2017 Fiscal Year Research-status Report

進行肝細胞癌に対する分子標的治療の効果を予測する新規バイオマーカーの探求

Research Project

Project/Area Number	16K19372
Research Institution	Kansai Medical University
Principal Investigator	山口隆志関西医科大学, 医学部, 助教 (10730202)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	Smad / TGF-beta / 肝癌 / ソラフェニブ
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、部位特異的リン酸化Smadを介する癌化シグナルが、進行肝細胞癌のリアルタイムな治療効果判定を可能にするバイオマーカーとして有用であることを示すことを目的としている。また、患者血中の循環癌細胞（Circulating Tumor Cell:CTC）の細胞内シグナルを解析することで、非侵襲的な検査で評価することを目指している。 28年度の実験でソラフェニブの細胞増殖抑制効果を反映して、リン酸化Smadシグナルが変化することを肝癌細胞株（Huh7, およびHepG2）を用いて確認した。本年度は、患者全血からCTCを同定するプロトコールを確立するために、肝癌細胞株（Huh７）を用いてさらに検討を重ねた。上皮細胞接着分子（epitherial cell adhesion molecule:EpCAM）は古くから知られる癌特異表面抗原であるが、上皮系腫瘍のマーカーであり、肝細胞癌における癌幹細胞マーカーの一つとして報告されている（Yamashita T, et al Gastroenterology 2009）。このEpCAMに基づく検出法がCTCの分析では多数報告されている。肝癌細胞株（Huh７）のpSmad3L陽性細胞がEpCAMを高発現していることを、蛍光免疫染色法で確認することを試みた。残念ながら、EpCAM陽性細胞にリン酸化Smadの共陽性を確認するには至っていない。28年度にリン酸化Smadシグナルが上皮間葉転換（Epitherial Mesenchymal Transition: EMT）に深く関わることを報告した（Yoshida K, Yamaguchi T, et al J. Clinical Medicine 2016）。幹細胞にも関与すると考えられ、EpCAMとリン酸化Smadシグナルが共陽性を示さないのはテクニカルな問題と考えている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 平成28年度は、培養細胞を用いて、ソラフェニブの増殖抑制作用をリン酸化Smadシグナルの変化で捉えることが可能であることを確認した。平成29年度は、ヒト全血から血中循環癌細胞 (Circulating tumor cells; CTC)を回収して、回収したCTCのリン酸化Smadシグナルの解析を行う方法（プロトコール）を確立することを目的に研究を進めた。CTCの検出は上皮細胞接着分子（epitherial cell adhesion molecule:EpCAM）に基づく方法で行うことを予定している。そこで、肝癌細胞株（Huh7）で部位特異的リン酸化Smad抗体（抗ｐSmad3L抗体）と抗EpCAM抗体を用いて、免疫細胞染色法で共陽性となる細胞があるか検討を行ったが、現在まで共陽性を示す細胞が確認できていない。免疫染色の固定法など条件を検討しているところである。ソラフェニブの投与が予定されている進行肝細胞癌の患者を選択し、血液を回収する準備は出来ているが、血液からCTCを回収する方法が確立出来ていないため、ヒト検体を用いた実験に進めていない。以上から、やや遅れていると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	平成28年度から引き続き抗EpCAM抗体および磁性粒子によるCTCの回収、回収したCTCのリン酸化Smadシグナルの解析を行う方法（プロトコール）の確立に努める予定である。そして、インフォームドコンセントの得られたソラフェニブの投与を予定している20症例を選択し、ソラフェニブ投与前と投与2週後に血液サンプルを回収する。回収した血液サンプルからCTCを単離し、リン酸化Smadシグナルの解析を行う。また、対象とした症例のソラフェニブの治療効果判定を、ソラフェニブ投与前、投与後1か月後、3か月後、6か月後にAFP, PIVKAIIの測定と、ダイナミックCTにて行う。なお、ソラフェニブは一般に腫瘍縮小効果が少ないことが知られており、ソラフェニブの効果を画像検査で評価する際には、腫瘍の壊死範囲を動脈相の濃染域の長径と短径で評価するmRESICT法にて行う。また、生命予後についても検討する。
Causes of Carryover	培養細胞を用いた実験で予想していた結果が得られず、磁気ビーズの購入を延期した。そのため、繰り越すこととなった。平成30年度は、引き続き培養細胞を用いた実験を行いながら、適切な時期にCTC回収のために用いる磁気ビーズ（抗EpCAM抗体）の購入に充てる予定である。