2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K19375
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
岡田 季之 久留米大学, 医学部, 助教 (10607328)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 炎症性腸疾患 / 胆汁酸 / AID / エピジェネティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
炎症性腸疾患患者の大腸粘膜において、AIDの異所性発現が誘導されることが知られている。また、クローン病患者の回腸末端で吸収される胆汁酸の腸管循環不全が知られていることから、流出した胆汁酸によりAIDの発現が誘導されるか検討を行っている。H28年度では、①大腸がん細胞株へ胆汁酸処理を行うことで、低発現ではあるがAIDのmRNAが誘導される可能性が示唆された。しかし、ウエスタンブロット(WB)法によりAIDタンパク質の発現解析を試みたが検出不可能であった。そこで、微量に発現するAIDを検出するためにポリクローナル抗体を作成し、タンパク質の検出を試みたが、その発現を確認することはできなかった。②次に、AIDを過剰発現させた安定発現株を作製後マイクロアレイ発現解析を行い、Mockと過剰発現株とで比較検討することで、Zスコアが２以上の遺伝子を619個単離することができた。単離した619遺伝子とYamane et al(Nat Immuno 2011)によって同定された、B細胞におけるAIDの標的遺伝子を比較検討しqPCRで確認したところ、AID過剰発現細胞株にて２倍以上発現変化したのは16遺伝子だった。そこで、この遺伝子のプロモーター領域でDNAの脱メチル化が認められるか、メチル化解析を行い16遺伝子中5遺伝子のプロモーター領域の脱メチル化が認められた。
デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を野生型マウスへ投与し大腸炎を誘導することで、野生型の大腸上皮細胞にAIDの異所性発現が認められる事を確認している。そこで５つの候補遺伝子の発現が、AID依存的に誘導されるのか検証するために、DSS投与後の野生型・AID欠損型マウスの大腸上皮細胞を精製し、5つの候補遺伝子のmRNAの発現を検討しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①大腸上皮細胞で胆汁酸が、AIDの異所性発現を誘導する可能性について示唆することができたが、タンパク質の発現については不明なままである。そこで、②AIDを発現しない大腸がん細胞株を用いたin vitroの実験系により、AID依存的に発現誘導される候補遺伝子を５遺伝子まで絞ることができた。現在では、in vivoの実験系においてDSS投与後の野生型マウスとAID欠損マウスの大腸上皮細胞で、５つの候補遺伝子がAID依存的に変化するか評価することで、最終目標の達成が大いに期待することができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
DSSによって大腸炎を誘導した野生型マウスとAID欠損マウスの大腸上皮細胞で５つの候補遺伝子がAID依存的に変化するか検討する。そして、大腸上皮細胞でAID依存的に変化する遺伝子のプロモーター領域の脱メチル化を、COBRA法またはバイサルファイトシーケンシング法などにより評価する。DSSにより大腸炎を誘導後、AID欠損型マウスの表現型解析を行う。
また、In vivoの実験系で同定した、AICDAの異所性発現により特異的に変化する遺伝子の機能解析を、大腸がん細胞株に遺伝子導入、ノックダウンまたは欠損させることで評価を行う。
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| Causes of Carryover |
当初予定していた、胆汁酸による遺伝子発現変化をマイクロアレイ解析にて行っていないため。また、脱メチル化解析を当初予定していた解析法では、高価なため予算の都合が合わなかったので、安価な方法でメチル化解析を行ったので、次年度使用額が生じた。
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