細胞ストレス防御機構の阻害を介したソラフェニブの抗腫瘍効果

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K19376
• Research Institution: University of Occupational and Environmental Health, Japan
• Principal Investigator: 本間 雄一 産業医科大学, 医学部, 助教 (30620984)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 肝細胞癌 / ソラフェニブ / 小胞体ストレス / 酸化ストレス / オートファジー / プロテアソーム

Outline of Annual Research Achievements

我々はこれまで、培養肝細胞において酸化ストレスや小胞体ストレスと細胞内の蛋白分解機構であるオートファジーに着目し研究を継続中である。培養肝癌細胞において、肝細胞癌に対するmultikinase阻害薬であるソラフェニブが、小胞体ストレスに対する防御機構であるunfolded protein response（UPR）や、肝細胞の中間径線維の構成成分のひとつであるケラチンのリン酸化を阻害し、さらに細胞内の異常蛋白の分解に重要な異常蛋白のユビキチン化や、細胞保護的に作用すると考えられているMallory-Denk body様の肝細胞内封入体の形成を阻害し、プロテアソーム阻害薬との併用で相乗的に細胞死を誘導することを報告した（Honma Y, Harada M, et al.Exp Cell Res 2013.）。他にもソラフェニブはAktの活性化を阻害し、下流のmTOR活性を阻害すること、さらに癌細胞の浸潤、転移に関わるJNK、p38といったstress-activated protein kinaseの活性を阻害し、抗腫瘍作用を発揮することを報告した（Honma Y, Harada M, et al. J Gastroenterol 2014.）。これらの機序として、ソラフェニブが異常蛋白のユビキチン化に関与するkinaseや、UPRの誘導に働く小胞体膜上のストレスセンサーであるIRE1αやPERKのリン酸化、PERK下流のeIF2αのリン酸化を阻害し、小胞体ストレスに対する癌細胞の脆弱性を誘導すると考えられた。これらの結果から、multikinase阻害薬であるソラフェニブは、従来報告されているRaf-1や受容体型tyrosine kinaseの阻害とは異なる、様々なkinase活性の阻害から抗腫瘍作用を示す可能性があり、抗腫瘍作用や副作用に関与すると考え検討を継続中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

酸化ストレスに対する細胞の防御機構であるKeap1-Nrf2系は、肝細胞癌を含む様々な癌腫で活性化されており、ソラフェニブがKeap1-Nrf2系に如何に作用するかを検討した。肝癌培養細胞にソラフェニブを付加し、Nrf2、Keap1、さらにNrf2の活性化に深く関与するp62のリン酸化について免疫染色、Western blotにて検討した。ソラフェニブはNrf2の核への移行を阻害しその活性化を抑制したが、その機序としてp62のリン酸化が抑制されたことから、p62のリン酸化が関与するKeap1とNrf2の解離が抑制されたことが、Nrf2の活性化を抑制したもの考えられた。このことからソラフェニブは肝癌細胞の酸化ストレスに対する防御機構を抑制し、抗腫瘍作用を発揮するとの結果を明らかとしている。またp62のリン酸化はMallory-Denk body様の肝細胞内封入体の形成にも重要であり、p62のリン酸化の阻害はケラチンのリン酸化の阻害とともに封入体形成抑制に関与すると考えている。

Strategy for Future Research Activity

5週齢のヌードマウス（BALB/c nu/nu）へヒト肝癌細胞株（Huh7、KYN-2）を皮下移植した肝癌xenograftモデルを作成し、コントロール群、ソラフェニブ（20mg/kg）投与群、プロテアソーム阻害薬であるボルテゾミブ（1mg/kg）投与群、mTOR阻害薬であるエベロリムス（5mg/kg）投与群、ソラフェニブ（20mg/kg）＋ボルテゾミブ（1mg/kg）投与群、ソラフェニブ（20mg/kg）＋エベロリムス（5mg/kg）投与群の6群に分け、それぞれの抗腫瘍効果を腫瘍径の評価により、酸化ストレスや小胞体ストレス、またそれら細胞ストレスに対する防御機構についてを皮下腫瘍およびマウス肝のウエスタンブロット、免疫染色にて評価する。マウスの体重や血液検査による肝機能障害への影響を検討し、薬物による副作用との関連も検討する。

Causes of Carryover

マウスモデルの検討で、結果の解釈に難渋している。引き続き多方面から追加検討を行っているが、予想よりも進行が遅れているため、免疫染色に対する抗体など物品費の経費の使用がなかったため次年度使用額が生じた。今後マウスモデルの腫瘍組織や肝組織の免疫染色、ウエスタンブロット等による追加検討を行う予定であり、抗体購入や免疫染色関連費用などに繰越金は使用する予定である。