日本最大検体数による難病疾患肺高血圧症原因遺伝子BMPR2未解明変異への挑戦

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K19424
• Research Institution: Kyorin University
• Principal Investigator: 相見 祐輝 杏林大学, 医学部, 特任助教 (60749696)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 肺動脈性肺高血圧症 / BMPR2遺伝子 / 未解明変異

Outline of Annual Research Achievements

肺動脈性肺高血圧症(PAH)は難治性疾患であり、原因不明の特発性PAHや遺伝性PAHでBMPR2、ACVRL1、ENG遺伝子などが発症に関与している。PAH症例の約三分の一にBMPR2遺伝子の点突然変異やエキソン欠失および重複が検出されるが、BMPR2遺伝子変異が陰性にもかかわらず末梢血中BMPR2 mRNA量の減少がしばしば観察される。すなわちPAH症例においてBMPR2遺伝子に未解明の変異が残されている可能性がある。他の多くの遺伝性疾患に見られるようにイントロン内の点突然変異/欠失/重複/転座に起因するスプライシング変異、またはエピジェネティクスな変化によるスプライシングバリアントの増加によりナンセンス変異依存mRNA分解機構（NMD）が発動していると推測する。本研究ではPAHでのスプライシング変異NMD仮説を次世代シークエンサーが苦手とする欠失/重複/転座を検出する解析法等を確立し、未解明変異制御機構への挑戦を行う。
平成28年度では①BMPR2遺伝子変異陰性かつmRNA発現量の減少症例の頻度を検討するためにBMPR2遺伝子変異陽性14症例とBMPR2遺伝子変異陰性32症例について末梢血中BMPR2 mRNA量をリアルタイムPCRにて比較定量した。BMPR2遺伝子変異陰性32症例中少なくとも3症例でBMPR2遺伝子変異陽性症例と同等のBMPR2 mRNA発現量の減少を認めた。②BMPR2遺伝子イントロン内欠失/重複/転座を検出するためのLongPCRアンプリコン制限酵素地図解析法を確立した。③スプライシングバリアント検出法の確立に取り組んだ。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

BMPR2遺伝子変異が陰性にもかかわらず末梢血中BMPR2 mRNA量の減少についてはBMPR2遺伝子変異陽性症例と比較検討することで客観的な評価が可能となった。またBMPR2遺伝子イントロン（約18万塩基）内に潜在する欠失/重複検出法に時間を要したが検出法を確立したこと、スプライシングバリアント検出法の確立に向けた取り組みを開始したため順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

①BMPR2遺伝子変異陰性かつmRNA発現量の減少症例の頻度を明らかにするために解析症例数を蓄積する。②BMPR2遺伝子変異陰性かつmRNA発現量の減少症例についてイントロン内に潜在する欠失/重複を確立した検出法でイントロン内変異の有無を検証する。③スプライシングバリアントの検出法の確立し、スプライシングバリアントの有無を検証する。④スプライシング変異およびエキソン欠失変異症例検体をマイトゲン処理により幼若化したリンパ球をNMD阻害薬で処理しBMPR2 mRNA の発現動態解析を行いNMD検出の可能性を検討する。

Causes of Carryover

当該年度にてスプライシングバリアントの検出法を確立する予定であったが確立には至らなかったため次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

スプライシングバリアントの検出法確立に必要となる実験消耗品に使用する。