内皮eNOS-NO産生機構活性化における基底膜分子パールカン機能ドメインの探索

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K19430
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 野中 里紗 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任研究員 (90614248)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 血管内皮機能 / 基底膜分子パールカン / 細胞外マトリックス

Outline of Annual Research Achievements

細胞外マトリックス（ECM）の発現異常や構造異常は、様々な疾患の発症・進行において認められており、ECM分子の機能解明・制御は、疾患治療へと結びつけることも期待されており、再生医療の分野においてもその重要性が注目されつつある。基底膜分子パールカンは、血管形成や形態維持だけでなく血管病変進行にも重要なECMであることや、脳血管障害における神経細胞保護作用も明らかになってきている。これまでの解析より、内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）の発現低下による内機能低下を引き起こし、内皮機能維持に重要であるを新たに見出している。本年度は、昨年度に引き続きパールカン欠損大動脈にて認められたeNOSの発現低下による内皮依存性機能低下に対するメカニズム解析の為、パールカンsiRNA処理をしたヒト大動脈内皮細胞（HAEC）を用いて、eNOSの発現変動に関与するシグナル分子の解析およびeNOSの活性化に関与するシグナル分子を中心に行う計画であった。パールカンsiRNAを処理したHAECを用いて、これまでに報告のあるeNOS発現変動関連分子を中心にウェスタンブロット法を用いて解析を行った。パールカンsiRNAの処理により、eNOS発現変動と関連が報告されているVEGFレセプターの発現が有意ではないが低下傾向を示すのを認めた。VEGFRのリン酸化においても有意な差は認められなかったため、パールカン欠損で認められた内皮機能低下は、VEGFシグナルカスケードを介したeNOSの発現低下の寄与が大きいと考えられる。現在は、パールカンのドメインのリコンビナントタンパク質を用いたレスキュー実験等の計画のため、パールカンドメインVのリコンビナントタンパク質を購入し解析準備を行っている。パールカンドメインVは脳血管疾患においては保護的に作用することが報告されていることから、今後は神経系との関連も重要であると考える。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成29年度は、平成28年度に得られた結果をもとに、引き続きパールカンの内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）発現変動に対するメカニズム解析を、パールカンsiRNA処理をしたヒト大動脈内皮細胞（HAEC）を用いて、eNOSの発現変動に関与するシグナル分子の解析を中心に行う計画であった。また、パールカンの機能ドメインタンパク質とそのメカニズムが明らかにすることを計画しており、パールカンのドメインⅠ－Ⅴのリコンビナントタンパク質を用いたレスキュー実験等の生化学的・分子生物学的解析を行う計画であった。しかし、パールカン機能ドメインのリコンビナントタンパク質の作製は引き続き行う予定であるが、作製工程に時間がかかる為、販売されているリコンビナントタンパク質は購入したドメインⅤのエンドレペリンを用いた実験から先に行う計画へ変更した。また、本実験で使用したヒト大動脈内皮細胞（HAEC）は、初代培養細胞として購入した細胞の為、細胞の安定的な長期維持が難しい点、siRNA処理に対する反応性が異なる時がある点により、研究遂行が遅れている。現在、別の細胞への変更も考慮している。eNOSの発現変動に関与するシグナル経路は明らかになりつつあるが、eNOSの活性化機構への関与に関しては、Ca非依存性経路の解析を行っているが、複数の経路があることもあり、まだ全て行えていない。現在、有意な結果が得られていない点も含め、統計解析向けての追加実験および別経路での解析が必要であると考える。Ca依存性経路の解析として予定していたFura-2を用いたカルシウムイメージング法による解析には進めていない為、そちらの解析を進める必要がある。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度は、平成29年度までに得られた結果をもとに、引き続きパールカンの内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）発現変動やeNOS活性化機構に対するメカニズム解析を、パールカンsiRNA処理をしたヒト大動脈内皮細胞（HAEC）を用いて、eNOSの発現変動に関与するシグナル分子の解析を中心に行う予定である。これまでに変動や活性化が認められたシグナルカスケードの更なる解析を行うとともに、パールカン機能ドメインⅠ-Ⅴのリコンビナントタンパク質を用いたレスキュー実験等を用いた生化学的・分子生物学的手法による解析を行う予定である。まずは、購入が可能なパールカン機能ドメインVのエンドレペリンによるレスキュー実験を行う。エンドレペリンは、脳血管系では細胞外タンパク質・血管内皮細胞・神経細胞のクロストークが示されており、神経系との関連も情報収集する予定である。また、NO産生のためのeNOS活性化機構とパールカンの関連は明らかにするための検討は、引き続きパールカンsiRNA処理をしたHAECを用いて、更なる解析を生化学的・分子生物学的手法により行う予定である。eNOSによるNO産生はCa2＋依存性・非依存性経路があり、複数の経路によって調節されているが、活性化経路に対する活性誘導薬物を用いた薬理学的解析等を用いて解析を行うとともに、Ca依存性経路の解析は、Fura-2を用いたカルシウムイメージング法により蛍光顕微鏡にて解析を計画している。また、形態に対するパールカンの有無の影響は、eNOS局在構造のカベオラを中心に電子顕微鏡を用いて形態学的に解析を行う。本研究の遂行により得られた結果をもとに、パールカンによる血管収縮・弛緩機能の調節機構を明らかにすると共に、パールカンおよび機能ドメインの血管系機能における役割について結果を取りまとめ、成果の発表を行う。

Causes of Carryover

前年度より、購入ヒト大動脈内皮細胞用いた方法に変更したが、本年度は以前から使用していた細胞のストック分で賄って研究を遂行した為、細胞購入費用がなかった。細胞培養関連試薬がおよびプラスチック製品は一部、前年度の残りを使用した為、細胞培養関連試薬の購入が予定より少なかった。次年度以降は細胞の購入、それに伴いsiRNAのような分子生物学解析に使用する関連試薬の購入が発生するので、その費用を次年度に繰り越し、購入する予定である。さらに、siRNAの手法に必要な関連試薬を購入する。購入可能なリコンビナントタンパク質は購入するが、購入できないパールカンドメイン各種リコンビナントタンパク質の作製も次年度に繰り越したため、それら関連試薬の購入費用を次年度に繰り越した。パールカンは、糖たんぱく質であるため、精製には細胞を用いるため、精製に必要な細胞の購入、培養関連試薬の購入が必要である。また、ウェスタンブロット法によるシグナル分子の解析には、現在所有している抗体以外に、別途関連シグナル分子に対する一次抗体および二次抗体の購入を行う。レスキュー実験では、遺伝子発現の変動を確認する為、PCR関連試薬の購入も必要であり、それらにかかる試薬・解析費用を含めている。また、神経系との関連も重要であると考える為、その情報収集のための書籍等、更なる研究推進のための情報収集のための学会等への参加費を含めている。