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2018 Fiscal Year Research-status Report

腎糸球体上皮細胞スリット膜の形成、維持におけるEphrin-B1の役割の解明

Research Project

Project/Area Number 16K19479
Research InstitutionNiigata University

Principal Investigator

福住 好恭  新潟大学, 医歯学系, 准教授 (20609242)

Project Period (FY) 2016-04-01 – 2020-03-31
Keywordsポドサイト / スリット膜 / Ephrin-B1 / Par-6 / NHERF2
Outline of Annual Research Achievements

ポドサイトにおける新規Ephrin-B1関連分子を同定するため、ポドサイト特異的Ephrin-B1ノックアウトマウス単離糸球体材料を用いた次世代シーケンサ解析を行った。その結果、Tight Junction関連分子であるPar-6を同定した。リアルタイムPCR法、及び免疫染色法による解析で、Ephrin-B1ノックアウトマウス糸球体でPar-6の発現低下が確認され、Par-6はEphrin-B1の関連分子であることが示された。
ポドサイトにおけるEphrin-B1とPar-6との関係を詳細に解析したところ、正常ラット糸球体でEphrin-B1とPar-6が共局在すること、蛋白尿を呈するネフローゼ症候群モデルラット糸球体で、病態誘導初期でEphrin-B1とPar-6の染色性の低下を発見した。発達期糸球体では、Ephrin-B1とPar-6はNephrin発現がまだ観察されないS字管期初期糸球体で発現が観察された。
HEK293細胞を用いた強制発現系の解析で、Ephrin-B1はPar complexの1つであるPar-3とは結合せず、Par-6と結合することを明らかにした。また、抗Nephrin抗体刺激によってリン酸化されたEphrin-B1は、Par-6と結合しないことを明らかにした。以上の結果から、Ephrin-B1とPar-6の相互作用が、ポドサイトスリット膜の機能維持に重要であることを示した。
また、Ephrin-B1と関連するPDZ domainを有する蛋白質を同定するため、Ephrin-B1ノックアウトマウス単離糸球体材料を用いて次世代シーケンサ解析を行ったところ、Ephrin-B1ノックアウトマウスで発現量に変化があったPDZ domain蛋白質NHERF2を同定した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度では、Ephrin-B1とPar-6の相互作用を詳細に解析した。ポドサイト特異的Ephrin-B1ノックアウトマウス糸球体で、Par-6の発現低下を観察した。正常ラット糸球体では、Ephrin-B1とPar-6の共局在、NephrinとPar-3の共局在を観察した。ネフローゼ症候群モデルラット糸球体では、病態誘導初期でEphrin-B1とPar-6の染色性の低下、蛋白尿ピーク時でNephrinとPar-3の染色性の低下を観察した。発達期糸球体では、Ephrin-B1とPar-6はNephrin発現がまだ観察されないS字管期初期糸球体で発現が観察された。
HEK293細胞を用いた強制発現系の解析で、Ephrin-B1はPar-3と結合せず、Par-6と結合すること、NephrinはPar-6と結合せず、Par-3と結合することを明らかにした。抗Nephrin抗体刺激によりリン酸化されたEphrin-B1は、Par-6と結合できないことを明らかにした。スリット膜特異的障害モデルある抗Nephrin抗体誘導腎症では、病態誘導1時間後からEphrin-B1がリン酸化されることから、Ephrin-B1とPar-6の結合が維持できず、スリット膜の構造が変化して、蛋白尿が発症することを示した。
また、PDZ binding domainを有するEphrin-B1と関連するPDZ domain蛋白質を同定するため、Ephrin-B1ノックアウトマウス単離糸球体材料を用いた次世代シーケンサ解析で、PDZ domain蛋白質NHERF2を同定した。
以上より、ポドサイトにおけるEphrin-B1とPar-6の相互作用を明らかにしたこと、Ephrin-B1関連PDZ domain蛋白質、NHERF2を同定したことから、本年度計画は順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

次世代シーケンサ解析により同定したNHERF2の解析を行う。具体的には、ポドサイトにおけるEphrin-B1とNHERF2との関係を明らかにするため、ポドサイト特異的Ephrin-B1ノックアウトマウス糸球体におけるNHERF2の発現解析を、リアルタイムPCR法、及び免疫染色法で検討する。また、正常ラット糸球体におけるEphrin-B1とNHERF2の局在解析を二重免疫染色法により解析する。
Ephrin-B1とNHERF2の相互作用を、HEK293細胞を用いた強制発現系により解析する。Ephrin-B1とNHERF2の相互作用がPDZ domainを介しているかどうかを明らかにするため、PDZ binding domain欠損Ephrin-B1ベクターを作製し、NHERF2との結合を免疫沈降法により検討する。また、NHERF2は2つのPDZ domainを有しており、Ephrin-B1がどのPDZ domainと結合するかを明らかにするため、それぞれのPDZ domain欠損NHERF2ベクターを作製し、Ephrin-B1との結合を免疫沈降法により検討する。Ephrin-B1とNHERF2の結合が観察された場合、抗Nephrin抗体刺激によるリン酸化Ephrin-B1とNHERF2が結合するかどうかを、NHERF2/Ephrin-B1/NHERF2のトリプルトランスフェクション材料を用いて検討する。
ネフローゼ症候群モデルラット糸球体におけるNHERF2の免疫染色染色を行い、蛋白尿発症にNHERF2の発現変化が関与しているかどうかを明らかする。NHERF2の発現変化が観察された場合、Ephrin-B1との二重染色を行い、Ephrin-B1との関連性を解析する。また、糸球体形成期におけるNHERF2の発現様式を検討するため、発達期糸球体におけるNHERF2の免疫染色を行う。

Causes of Carryover

研究が順調に進んだため、さらなる解析に必要な遺伝子改変マウスの飼育経費、及び相互作用解析に必要な試薬を購入するため。

  • Research Products

    (14 results)

All 2019 2018 Other

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (12 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 2 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Nephrin-Binding Ephrin-B1 at the Slit Diaphragm Controls Podocyte Function through the JNK Pathway2018

    • Author(s)
      福住好恭、張瑩、山岸稜平、小田佳奈子、渡辺徹、松井克之、河内裕
    • Journal Title

      Journal of the American Society of Nephrology

      Volume: 29 Pages: 1462-1474

    • DOI

      10.1681/ASN.2017090993.

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 腎糸球体上皮細胞におけるJNKシグナルの役割2019

    • Author(s)
      福住好恭、張瑩、安田英紀、河内裕
    • Organizer
      第92回日本生化学学会
    • Invited
  • [Presentation] NHERF2 interacts with cytoplasmic domain of ephrin-B1 at the slit diaphragm of podocyte2019

    • Author(s)
      福住好恭、張瑩、安田英紀、河内裕
    • Organizer
      第62回日本腎臓学会
  • [Presentation] メサンギウム増殖性腎炎におけるTh17細胞の関与について2019

    • Author(s)
      渡辺秀平、安田英紀、張瑩、福住好恭、河内裕
    • Organizer
      第62回日本腎臓学会
  • [Presentation] 腎糸球体におけるタクロリムス, シクロスポリンAの結合蛋白質の発現解析2019

    • Author(s)
      安田英紀、福住好恭、張瑩、河内裕
    • Organizer
      第62回日本腎臓学会
  • [Presentation] スリット膜の新たな機能分子2018

    • Author(s)
      福住好恭、張瑩、河内裕
    • Organizer
      第61回日本腎臓学会
    • Invited
  • [Presentation] Nephrin-binding ephrin-B1 at slit diaphragm controls podocyte functions through JNK pathway2018

    • Author(s)
      福住好恭、張瑩、安田英紀、河内裕
    • Organizer
      第61回日本腎臓学会
  • [Presentation] キサンチン酸化還元酵素阻害薬トピロキソスタットのポドサイト保護作用2018

    • Author(s)
      張瑩、福住好恭、中村敬志、芦澤直樹、河内裕
    • Organizer
      第61回日本腎臓学会
  • [Presentation] ポドサイト傷害モデルの糸球体におけるFKBP12の発現2018

    • Author(s)
      安田英紀、張瑩、福住好恭、河内裕
    • Organizer
      第61回日本腎臓学会
  • [Presentation] Interaction of the Par-complex with Ephrin-B1/Nephrin plays an essential role in podocyte2018

    • Author(s)
      高村紗由里、福住好恭、張瑩、安田英紀、成田一衛、河内裕
    • Organizer
      第61回日本腎臓学会
  • [Presentation] Ephrin-B1 at slit diaphragm controls podocyte functions through JNK pathway independently of nephrin signaling2018

    • Author(s)
      福住好恭、張瑩、河内裕
    • Organizer
      第12回国際ポドサイトカンファレンス
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Identification of cytoplasmic proteins associated with Ephrin-B1 at the slit diaphragm of podocyte: PDZ proteins, Par6, Par3 and NHERF2 are associated with Ephrin-B12018

    • Author(s)
      福住好恭、高村紗由里、張瑩、安田英紀、河内裕
    • Organizer
      第51回米国腎臓学会
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] FK506 binding protein (FKBP12) is highly expressed in glomerular podocyte in kidney: FKBP12 in podocyte is co-localized with actin cytoskeleton and is re-distributed in injured podocytes2018

    • Author(s)
      安田英紀、福住好恭、張瑩、河内裕
    • Organizer
      第51回米国腎臓学会
    • Int'l Joint Research
  • [Remarks]

    • URL

      https://www.med.niigata-u.ac.jp/nim/welcomej.html

URL: 

Published: 2019-12-27  

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