2016 Fiscal Year Research-status Report
次世代シーケンサー解析によるネフローゼ症候群の新規治療標的分子の探索
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16K19483
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
張 エイ 新潟大学, 医歯学系, 助教 (00529472)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ネフローゼ症候群 / 蛋白尿発症 / 次世代シーケンサー / RNA-seq解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
蛋白尿発症に関わる新規分子を同定するために、二種類のネフローゼ症候群の病態モデルを用い、次世代シーケンサーRNA-seq解析により、ネフローゼ症候群の腎糸球体における発現変動分子を同定し、バイオインフォマティクス解析を行った。
ANA（anti-nephrin antibody）腎症モデル（スリット膜特異的障害モデル）では、正常コントロールと比較し、腎症誘導直後（1h、蛋白尿の出現前）にmRNA発現量が50％以下に低下した870分子、2倍以上に上昇した880分子を同定した。蛋白尿のピーク時（Day 5）では、同様に低下した601分子、上昇した794分子を同定した。病態誘導直後に発現低下した細胞膜分子を用い、分子機能と細胞シグナル伝達パスウェイに関する情報をGene Ontology（GO）とKEGG pathwayで解析したところ、Rap1 signaling pathwayに関わる分子群（15分子）が出現頻度の有意に高いシグナル分子群として検出された。これらの分子は、スリット膜の機能維持に重要な役割を果たしていることを示した。
PAN（Puromycin aminonucleoside）腎症モデル（微小変化型ネフローゼ症候群モデル）では、正常コントロールと比較し、腎症誘導直後（1h、蛋白尿の出現前）にmRNA発現量が50％以下に低下した1748分子、2倍以上に上昇した999分子を同定した。蛋白尿のピーク時（Day 10）では、同様に低下した1460分子、上昇した848分子を同定した。病態誘導直後に発現低下した分子を用い、GOとKEGG pathway解析を行ったところ、細胞膜表面に局在する67分子は出現頻度の有意に高い分子群として検出され、そのうちの13分子は、細胞接着分子であることが明らかとなった。これらの分子の発現低下と機能低下が蛋白尿発症に関与していることを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
1. スリット膜特異的障害モデル（ANA腎症）と微小変化型ネフローゼ症候群モデル（PAN腎症）のネフローゼ症候群モデルを作製した。両モデルの病態誘導直後、蛋白尿のピーク時の腎糸球体のmRNAの配列解読と発現測定をRNA-seq法で行った。
2. RNA-seqの測定データを用い、正常コントロール群との比較解析を行い、発現変動分子を同定した。ANA腎症では、腎症誘導直後（1h、蛋白尿の出現前）に発現が50％以下に低下した870分子、2倍以上に上昇した880分子を同定した。蛋白尿のピーク時（Day 5）では、同様に低下した601 分子、上昇した794 分子を同定した。PAN腎症では、腎症誘導直後（1h、蛋白尿の出現前）に発現が50％以下に低下した1748分子、2倍以上に上昇した999分子を同定した。蛋白尿のピーク時（Day 10）では、同様に低下した1460分子、上昇した848分子を同定した。
3. 両モデルにおいて、病態誘導直後（蛋白尿の出現前）にｍRNA発現低下した分子を用い、Gene OntologyおよびKEGG pathway法で解析した。Rap1 signaling pathwayに関わる分子群（15分子）と細胞接着分子群（13分子）がスリット膜の機能維持に働き、これらの分子の発現低下、機能低下は蛋白尿発症に関わる可能性を示した。
4. 更に、ANA腎症の病態誘導直後と蛋白尿のピーク時の両時期にともに発現上昇分子の解析を行った。その結果、1hに比べ、Day 5での発現がさらに上昇した101分子が検出された。そのうち、細胞外分泌分子群（28分子）がGO解析で有意に検出された。これらの分子は病態、病勢診断マーカーの候補分子として有用であることを示した。
蛋白尿発症に関わる新規分子を同定するために、以上の研究を行った。進捗状況により、当初の計画以上に進展していると考えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
スリット膜障害と蛋白尿発症に関与する可能性のある分子について、糸球体濾過バリアの構造と機能維持のための役割を検討する。
1．候補分子の生理的な状態で腎臓内の局在と発現を検討する。バイオインフォマティクス解析からリストアップした候補分子について、まず、ラット糸球体に発現しているかどうかをRT-PCR法で確認する。そして、確認できた分子について、正常ラット腎を用い、候補分子の腎糸球体における局在と発現を免疫蛍光染色、Western blot法で調べる。さらに、正常糸球体において、候補分子と既知のポドサイト機能分子との位置関係を二重蛍光染色と免疫沈降法で検討する。一方、培養ポドサイトにおける候補分子の発現と局在を検討する。ラットの腎組織と培養細胞系で候補分子のmRNAとタンパク質レベルの発現と局在を確認してから、腎摘術由来のヒト腎材料を用い、候補分子のヒト糸球体における発現と局在を免疫蛍光染色で検討する。
2．蛋白尿発症における候補分子の糸球体での局在と発現の動態変化を検討する。動物の病態モデルを用い、候補分子の糸球体での分布パターンと発現量の変動を免疫蛍光染色、Western blot、Real-time PCR法で検討する。病態モデルで発現変動が確認できた分子について、ネフローゼ症候群の患者の腎生検試料を用いてさらに検討する。
3．候補分子の蛋白尿発症における役割を検討する。候補分子が関与するシグナル伝達を阻害する試薬の効果と培養細胞系と実験動物モデルで検討することによって、候補分子の糸球体濾過バリアの構造と機能維持に関わる役割を解析する。動物モデルの解析によるスリット膜の機能維持に重要な役割を果たしている可能性の高い分子について、ノックアウトマウス実験を計画し、候補分子の蛋白尿発症に関わる役割を解析する。
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| Causes of Carryover |
2016年度にネフローゼ症候群の動物モデルを用い、次世代シーケンサーRNA-seq解析により、正常と病態の腎糸球体におけるmRNAの配列解読と発現測定を行った。サンプル作製とRNA-seq解析を行った時に、使用したcDNAライブラリー作製用試薬キット（Ion Total RNA-seq Kit v2、Thermo Fisher）とシーケンシング解析用試薬と消耗品キット（Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit、Thermo Fisher）の一部は、教室の既存のものであった。この状況により、次年度の使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
2017年度以降、スリット膜障害と蛋白尿発症に関与する可能性のある分子について、病態モデルの腎糸球体における局在と発現動態を検証し、糸球体濾過バリアの構造と機能維持のための役割を検討する。この部分の研究費は、これらの実験のために、実験動物と培養細胞系のsiRNA実験用試薬の購入費の一部として使用する予定である。
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