Search of essential substrates of Parkin in Parkinsonism

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K19523
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 荒野 拓 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 博士研究員 (80750091)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ミトコンドリア / Parkin

Outline of Annual Research Achievements

ドーパミン神経細胞特異的なParkinによるユビキチン化タンパク質候補の探索を行った。方法として、ビオチン化酵素BirAを１つとビオチン化配列を付加されたユビキチンを6つ連結させた人工タンパク質（BirA-BioUb6）をドーパミン神経に発現させる。ネガティブコントロールとして、BirAのみ発現させたハエを用いた。ビオチン付加ユビキチンを用いたユビキチン化タンパク質濃縮方法を用いて実験を行った。始めにどのくらいの匹数が必要か、ドーパミン神経特異的ビオチン付加ユビキチン発現ハエを用いて試験を行った。濃縮されたユビキチン化タンパク質はSDS-PAGEで分離したのち、銀染色でタンパク質のバンドが見えるか行った。100匹分の頭部から検討を始めたが、バンドが薄く、質量分析で解析できなかった。ビオチン付加ユビキチンの回収量を増やすため、以下の3つの方法を検討した。1）匹数を1000匹に増やす。2）ビオチン添加餌を用いる。3）Parkinを過剰発現させる。しかしながら、ユビキチン化タンパク質の回収効率は上がらず、期限までに質量分析による解析ができなかった。