short-form GIPの測定系の確立による分泌機構と生理学的意義の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K19527
• Research Institution: Asahikawa Medical College
• Principal Investigator: 竹田 安孝 旭川医科大学, 大学病院, 医員 (90431402)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: GIP (1-30) / ELISA / 糖代謝

Outline of Annual Research Achievements

新たなインクレチンとして、GIP (1-30)が注目されているが、測定系は確立されておらず、分泌動態や生理学的意義は明らかではない。本研究では、GIP (1-30)に高い特異性を有するELISA法での測定系を確立し、生理的なGIP (1-30)の分泌動態および糖尿病における分泌異常の有無を探求することを目的とし検討を行った。
特異性の高いELISA法を構築する上で、既存のGIP (1-42)のN末端を認識する抗体に加え、新たにGIP (1-30)のC末端を特異的に認識する抗体を作成し、これら2種の抗体でのサンドイッチ法による特異的ELISA系を作成する方針とした。
GIP (1-30)のC末端ペプチドとして、GIP (24-30)ペプチド（8mer、CNWLLAQK-NH2、 MW 974.2）を合成した。ウシサイログロブリンをキャリア蛋白として、GIP (24-30)をBDF1マウス、BALB/cマウス、Wister Ratに免疫を施し、いずれにおいても抗原固相ELISAにて抗体価上昇が確認され、最終免疫、細胞融合に進んだ。Wister RatでGIP (1-30)amideのC末端特異的抗体をクローニングした。これをbiotin化し、特異的一次抗体とした。既存のGIP (1-42) N末端に対する特異的抗体をHRP標識し、これをHRP標識二次抗体とした。
こうしてGIP (1-30)に対する新規ELISA系を構築した。GIP (1-30) amideを用いた検討で、用量依存性のGIP (1-30)を検出した一方、GIP (1-42)に対する交差性は0.1％以下であった。
食事負荷試験における検討で、健常者、糖尿病患者ともに食事負荷後にGIP (1-30)の分泌が増加することが明らかとなった。また、DPP-4阻害薬により血中濃度が増加することが確認された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

‘short-form’GIPであるGIP (1-30)のELISA系を新たに構築した。これを用いて、GIP (1-30)が食事負荷による分泌増加を示すこと、DPP-4阻害薬により血中濃度が上昇することを確認した。これらの結果は、既知のインクレチンと同様の分泌動態であり、新たな知見が得られたと考えている。

Strategy for Future Research Activity

健常者での糖負荷試験、食事負荷試験等を重ね、生理的なGIP (1-30)の分泌動態について検証する。さらに、軽度の耐糖能異常 (IGT、IFG)を有する症例、2型糖尿病症例において同様に検証し、健常者との分泌動態の差異について比較・検証する。
既存のイムノアッセイ法 (RIA、ELISA)やバイオアッセイ法との差異について検証する。
インスリン分泌指標やβ細胞機能指標、インスリン感受性指標等とGIP (1-30)の分泌動態との関連を検証し、糖代謝におけるGIP (1-30)の位置づけを明らかにする。
ヒトにおける検討に加えて、培養細胞や単離膵島を用いて、生理的な分泌刺激因子、分泌抑制因子を探求する。

Causes of Carryover

理由：結果として物品の購入額が減ったため。
使用計画：一般的な生化学試薬，分子生物学的実験試薬，抗体，細胞培養試薬，培養器具等の購入，また実験動物の購入費および飼育費に充てる予定である。