2017 Fiscal Year Research-status Report
肥満減量手術モデルラットの消化管から分泌される機能性タンパク質の生理機能の解明
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16K19553
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
丸山 圭介 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (20612386)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 肥満減量手術 / 減量手術モデルラット |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、肥満減量手術モデルラットを確立して、減量手術における体重減少、糖代謝改善に寄与する内分泌的メカニズムの解明を主たる目的とする。
本年度は、引き続き減量手術（RYGB）モデルラットの表現型解析を進めた。まず、術後3週、7週、11週時点においてOGTTを実施し、血中インスリン濃度の変化を調べた。その結果、術後7週、11週において、糖負荷から30分後にはRYGB群のインスリン値は高値を示した。一方、Sham群やペアフェド群においては、そのような高値が認められないことから、RYGBラットは体重減少とは無関係に、グルコース応答性のインスリン分泌が亢進していることが示唆された。そこで、IPGTTを行い血中インスリン濃度の変化を調べ、OGTTの結果と比較した。すると、IPGTTにおいては、糖負荷から30分後の血中インスリン値はSham群と同程度の低い値であった。すなわち、RYGBラットにおいて観察されたグルコース応答性インスリン分泌の亢進は、消化管から分泌される何らかの因子よって仲介される可能性が示唆された。
そこで消化管を採取し、既知の消化管ホルモンの遺伝子発現をいくつか調べたところ、消化管の部位によってはGLP-1前駆体遺伝子やCCK遺伝子の発現が変化していることがわかってきた。さらに、RYGBラットの消化管のRNA-Seq解析において、発現変化している、分泌性タンパク質をコードすると予想される未知の遺伝子がいくつか存在することを確認した。
本年度の成果より、我々のRYGBラットにおいてはグルコース応答性インスリン分泌が亢進していることが見出された。さらに、減量手術により消化管ホルモンなどの発現が大きく変化していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度の研究成果をもとに、本年度は予定通りグルコース負荷試験等の表現型解析を進め、我々のRYGBラットにおいては、摂食量と体重の減少とは無関係に、グルコース応答性インスリン分泌が亢進していることを見出した。また、これはOGTTのみで観察され、IPGTTにおいては認められない。つまり、このグルコース応答性インスリン分泌の亢進が、消化管から分泌される何らかの因子によって仲介されることが示唆される。さらに、RYGBラットの消化管におけるペプチドホルモンの遺伝子発現解析を実施し、いくつかの既知の消化管ホルモンの発現が変化していることを明らかにした。これらの結果は、本研究課題を遂行する上で好個な減量手術モデルラットを確立できたことを示している。また、当初計画していた膵β細胞株を用いたin vitroアッセイ系の確立についても、予定通り実施した。膵β細胞株の細胞内Ca2+濃度の変化を指標としたアッセイ系については既に構築したものを保有しており、予備検討としてインスリン分泌を誘起することが知られているいくつかのペプチドホルモンを添加したところ、細胞内Ca2+濃度の上昇を確認した。また、膵β細胞株からのインスリン分泌を指標としたアッセイ系についても検討し、構築した。このアッセイ系についても既知のペプチドホルモンの活性評価が可能であることが確認できた。
一方、RYGBラットの消化管のRNA-Seq解析より見出された、消化管に発現する新規分泌性タンパク質をコードすると考えられる遺伝子に関して、cDNAクローニング、発現分布の解析等を行っているが、想定よりも遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究実績の概要等に記載した通り、本年度はRYGBモデルラットの表現型の解析をさらに進めた。経口糖負荷試験の際に観察されたインスリン分泌の亢進に関しては、GLP-1の関与があるか否か、ELISA、DPP-4阻害剤を用いて検討する。
また、RYGBラットの消化管のRNA-Seq解析より見出された、消化管に発現する新規分泌性タンパク質コードすると考えられる遺伝子に関して、さらなる機能解析を遂行する。さらに、上記の新規分泌性タンパク質の機能解析が難航した場合に備え、RYGBラットの消化管組織抽出物からの生理活性物質の探索が可能か否か、予備検討を行う。活性評価のためのアッセイ系は、上記の膵β細胞株を用いたin vitroアッセイ系を使用する。
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| Causes of Carryover |
（理由）本年度は、主にモデルラットの表現型解析を進めたが、糖負荷試験等の動物実験において、当初計画よりも研究費を必要としなかった。また、新規遺伝子がコードするタンパク質の機能解析が計画よりも若干遅れたため、必要な試薬・消耗品の購入を来年度に繰り越した。
（使用計画）上記の通り、動物実験及び膵β細胞株を用いたin vitroアッセイ系に使用する。また、新規遺伝子がコードするタンパク質の機能解析が計画よりも若干遅れているため、代替となる実験にも充当する予定でいる。
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