メトトレキサートの効果・副作用発現における標的蛋白質の同定と機序の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K19592
• Research Institution: Akita University
• Principal Investigator: 面川 歩 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80722066)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: メトトレキサート / 免疫調整役 / X線構造解析 / 酵素活性 / アフィニティー

Outline of Annual Research Achievements

本研究では，免疫調整薬（抗リウマチ薬など）として使用されるメトトレキサート(MTX)の標的蛋白質と，その機能の検討を目的とする．
メトトレキサートをセファロース担体とカップリングさせ，ウシ脾臓からの抽出液を用いてDrug affinity chromatographyを実施した．その結果，MTXの標的蛋白質として知られているdihydrofolate reductaseの他に，複数の標的蛋白質がバンドとして確認された．そのうちの1つの蛋白質のアミノ酸配列を解析したところ，蛋白質Aであることを同定した．蛋白質Aは，免疫を活性化させるレセプターに結合するリガンド蛋白質であり，酵素活性を持つことが知られている．上記の結果をもとに，大腸菌による発現系を用いてリコンビナント・ヒト蛋白質Aを精製し，以下の検討を行った．
・3次元構造：リコンビナント・ヒト蛋白質Aを結晶化させX線構造解析を行い，既報の蛋白質Aの3次元構造との合致を確認した．
・MTX存在下における蛋白質A酵素活性：ＭTXの存在下では蛋白質Aの酵素活性が低下することが確認された．また蛋白質Aの二次構造には影響がないことが判明した．
・蛋白質AとＭTXのアフィニティー：蛍光スペクトル測定によりMTXと蛋白質Aの結合能を検討したところ，kd値がμＭクラスの結合能であることが示された．
現在，上記までの内容をもとに論文の投稿を準備中である．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成28年度における目標として：MTXによるDrug affinity chromatographyを行い，既報の蛋白質以外の蛋白質を精製・同定すること，ヒトリコンビナント蛋白質を作成することなどを目標としていた．
蛋白質Aが同定され，ヒト・リコンビナント蛋白質Aが精製された．またリコンビナント蛋白質を用いて酵素活性の測定，結晶化によるX線構造解析を平成28年度に行うことができた．

Strategy for Future Research Activity

平成29年度以降は，ヒト・リコンビナント蛋白質AとＭTXの複合体を結晶化させＸ線構造解析を行うことで，MTXが蛋白質Aへの結合様式を判明させ，蛋白質Aの機能にどのような作用を示すか検討する．
また，蛋白質Aには類似した蛋白質Bがあることが知られており，いずれも同じレセプターのリガンドとして作用するとされているが，その機序は分かっていない．
MTX存在下での蛋白質A，蛋白質Bとレセプター複合体の相互作用を解析するため，リコンビナント蛋白質Bおよびレセプターの精製，結晶化，capture assayによる蛋白質A/Bとレセプターの影響の検討，蛋白質A/Bとレセプターの共結晶化，X線構造解析などを推進する．

Causes of Carryover

Drug affinity chromatographyの実施，蛋白質の同定，リコンビナント蛋白質を作成には，今までの予備研究では困難が予想されており，申請時点では様々な方法による精製や同定を行う可能性を考慮した金額を算出，計上していた．
また，H28年度は当初計画と異なり旅費が発生しなかった．

Expenditure Plan for Carryover Budget

今後は関連する蛋白質・レセプターのリコンビナント蛋白質の精製，Ｘ線の構造解析を行う予定である．
また，研究の進捗によっては細胞内シグナルの検討を行う可能性があり，それら詳細な検討に使用する計画である．