分子バーコード法を用いた自己炎症性疾患の低頻度モザイク検出パイプラインの構築

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K19640
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 井澤 和司 京都大学, 医学研究科, 助教 (90634931)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 自己炎症性疾患 / 分子バーコード / 遺伝子診断

Outline of Annual Research Achievements

自己炎症性疾患とその類縁疾患は、主に自然免疫にかかわる分子の遺伝子異常によって発症する。その中で、機能獲得型変異によって発症する疾患においては、ヘテロ変異のみならず、低頻度のモザイク変異でも発症し、一部の疾患は遺伝子欠失によって発症する場合もある。然しながら、低頻度モザイクや欠失を検出する遺伝子解析システムは十分に確立されておらず、診断の遅れや患者QOLの低下を招いている。本研究では、分子バーコード法とマルチプレックスPCR、次世代シーケンシングを組み合わせて行うことで、自己炎症性疾患および類縁疾患において、低頻度モザイクと遺伝子欠失・コピー数異常の検出を可能とするパイプラインの構築を目指す。分子バーコード法によるアリル数の絶対定量とモザイク変異検出の実現のために、最も自己炎症パネル解析に適した、効率的な次世代シーケンシングライブラリー構築法を確立する。
これまで基礎検討として、ハイブリキャプチャー法を試みた。ゲノムDNAを断片化し、分子バーコードを有するアダプターを付加したライブラリーを作製し、キャプチャープローブとハイブリダイズさせる事により目的領域の濃縮を行うことが可能であった。健常人コントロールでこの系が機能することは確認でき、データの蓄積を行った。
今後は既知の欠失や既知のモザイク変異を有する検体を用いて、変異が検出可能かを検証する。また、以前構築したNLRP3もモザイク検出パイプラインと比較検討する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

自己炎症性疾患とその類縁疾患を対象に、分子バーコード法と次世代シーケンサーを用いて１）低頻度モザイク変異、２）欠失、コピー数異常を検出するパイプラインを構築することを目的とした。
現在までに、ハイブリキャプチャー法を試みた結果、健常人コントロールにおいて、キャプチャープローブとハイブリダイズさせる事により目的領域の濃縮を行うことが可能であった。また同時に既知の欠失や既知のモザイク変異を有する検体の集積を行うことが可能であった。
平成28年度に予定したことは概ね達成できており、ほぼ予定通りに進行しいる。

Strategy for Future Research Activity

これまでに蓄積した健常人データをもとに、既知の欠失や既知のモザイク変異において変異を検出可能か試みる。
プラスミド混合実験を行い、その変異検出限界を確認する。また、以前構築したNLRP3モザイク検出パイプラインと比較検討する予定である。

Causes of Carryover

次年度に繰り越し、分子生物学的試薬の購入に使用するため

Expenditure Plan for Carryover Budget

分子生物学的試薬の購入に使用するため