動脈硬化早期における未知の内因性NOD1リガンドの検索

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K19651
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 神野 俊介 九州大学, 大学病院, 助教 (60725919)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 無菌マウス / 突然死 / Folch法

Outline of Annual Research Achievements

未知の内因性Ｎｏｄ１リガンドがマウス体内に存在し動脈硬化の進展に関与するという仮説を証明するため、無菌環境という外因性Ｎｏｄ１リガンドのない状態において、Ａｐｏｅ ＫＯマウスとＡｐｏｅ・Ｎｏｄ１ ＤＫＯマウスの動脈硬化病変を比較した。予備実験では、少数のマウスではあるものの、無菌環境においてもＮｏｄ１ ＫＯにより動脈硬化病変の軽減効果が見られていた。この現象の再現性を確認するために、Ａｐｏｅ ＫＯマウスとＡｐｏｅ・Ｎｏｄ１ ＤＫＯマウスを無菌で飼育して動脈硬化病変を評価した。しかし、無菌状態飼育マウスの突然死が多く、各群２匹しか評価ができず、Ａｐｏｅ・Ｎｏｄ１ ＤＫＯマウスにおいてプラークが少ない傾向があったものの統計学的な有意差判定はできなかった。
一方、Ａｐｏｅ ＫＯマウスのプラークや血管組織における内因性リガンドの検索のため、通常飼育下のＡｐｏｅ ＫＯマウスから組織を摘出し、組織をホモジナイズして酢酸エチルで脂溶性、中間層、水溶性成分を分離した後（Ｆｏｌｃｈ法）、濃縮を行い、ＮＯＤ１レポーター細胞で活性を測定した。しかし、いずれの抽出層の反応も、Ｎｕｌｌ細胞における反応と有意な差はなかった。ポジティブコントロールを用いて、濃縮や脱塩などの過程を確認したが、濃縮や脱塩の過程を経ない方が活性は高いことがわかった。ＮＯＤ１レポーター細胞の感度以下のリガンドしか抽出できていない可能性があり、元となる組織量を増やす必要があるかもしれない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

飼育中に突然死する無菌マウスが多く、評価ができていない。飼育環境に大きな変化はなく原因が特定できていないが、再度実験を行う。
抽出・濃縮の過程に問題がある可能性はある。あるいはHEK-Blue mNOD1 cellの感度以下のリガンドしか抽出できていない可能性がある。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、無菌マウスの飼育を行う。
マウスから摘出する組織の量を増やし、ホモジナイズ、抽出、測定までの時間・条件に注意する。

Causes of Carryover

従来より当教室で行っていた実験系であったため、既存の物品で賄うことが可能であった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

今後必要となる既存物品の補充、マウスの追加飼育に用いる。