高分子ゲルを用いたHER2過剰発現評価の新規定量化陽性コントロールの開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K19886
• Research Institution: Akita University
• Principal Investigator: 寺田 かおり 秋田大学, 医学部, 医員 (60610748)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: HER2 / 乳癌 / 免疫染色 / 陽性コントロール / 高分子ゲル / 定量化

Outline of Annual Research Achievements

乳癌は、本邦における女性の悪性腫瘍の罹患率第1位である。手術、薬物療法、放射線療法といった集学的治療が行われ、近年の薬物療法による治療効果は極めて高い。特に薬物療法の方針決定の際には、癌組織のホルモンレセプターや、癌細胞膜に存在するHER2 (human epidermal growth factor type2：ヒト上皮成長因子受容体2型)タンパクの発現状態を知ることが必要で、病理組織学的検査として免疫組織化学法Immunohistchemitry：IHC, 以下IHC) が用いられている。HER2陽性乳癌は、トラスツズマブに代表される抗体療法の進歩に伴い著しく予後の改善がみられている。そのため乳癌患者の中からHER2陽性乳癌患者を正確に見出すことは、乳癌の治療戦略を立てるうえで非常に重要で、診断精度の向上が望まれる。HER2タンパク過剰発現の診断は、IHCで癌細胞膜の染色強度により4段階に判定されるが、これは主観によるところが大きく、FISHなど他の検査との結果の乖離も認められる現状などから、染色強度を客観的に判定する方法の検討が必要である。一方で、当研究室ではこれまで、川口らとともに、ナノテクノロジーの技術を応用し、高分子化合物を用いて、機能性微粒子を用いた癌治療戦略に関する研究 (課題番号：20390338) を行なってきた経緯があり、タンパク質と結合する基を持つミクロンオーダーの親水性網目構造体 (＝高分子ゲル) の合成が可能であることを確認した。そこで、高分子ゲルにHER2タンパクを結合させ、免疫染色の原理で染色し、その結合するタンパク量によって染色強度に濃度差をもたせ、HER2タンパクの染色強度の陽性コントロールを作成するという着想に至った。ここに画像解析技術を用いて染色強度を数値化し、定量的なHER2免疫染色強度の陽性コントロールを開発する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

H28年度はHER2タンパク濃度の勾配を持った高分子ゲル微粒子の作成と画像解析への応用を課題とした。今回使用する高分子ゲルは、4種類のモノマー(Acrylamide, ethacrylic acid, Nitrophenyl acrylate, Methlene-bis-Acrylamide)の重合体であり、タンパク質と結合する基をもつミクロンオーダーの親水性網目構造体である。抗HER2抗体を用い、免疫染色を行なうと、HER2陽性乳癌と同様に染色性を示す球体として顕微鏡で観察される。高分子ゲルの作成は再現性をもって行うことができている。更に高分子ゲルに添加するHER2タンパクの濃度差によって染色強度に差が生じ、癌細胞膜の染色強度の陽性コントロールとなる。乳癌細胞の HER2 発現はパラフィン包埋組織を用いて判定するため、パラフィン包埋する際、 高分子ゲルも一緒に包埋する。これを切片にし、乳癌組織と同一プレパラート上で同時に免疫染色を行ない評価する。現時点では、凍結切片で異なるHER2タンパク量を添加した高分子ゲルを免疫染色し、染色濃度に差が出ることを確認できている。パラフィン切片では、抗原不活化処理などの工程で高分子ゲルが剥がれることのないよう、シランコーティングスライドガラスなどを用いて最適条件を模索中である。画像解析に関しては、高分子ゲルをより解析に適した条件にするため、電子顕微鏡の標準球を用いてコアとし、その表面に高分子ゲルを結合させる方法を試みている。標準球は正円球であり、生体にはない形態のため、画像解析で陽性コントロールを認識するのが容易となる利点がある。標準球の表面に無数の高分子ゲルを結合させ固相化し、その部分を画像解析で濃度測定する方法を現在進めている。

Strategy for Future Research Activity

高分子ゲル単独では画像解析時にやや小さい点と、パラフィン切片での染色時に剥離しやすい傾向があるため、この２点については最適方法を検索する必要がある。具体的には、①シランコーティングのスライドグラスを用いる。現在市販されているものもあるが、より再現性のある正確なデータを出すため、研究室で実際に作成して最も剥離しにくい条件を設定する。②画像解析には、電子顕微鏡の標準球を用いる。標準球は反応基を有しており、中でもアミノ基を持つものが高分子ゲルとの結合性に優れている。そこで、アミノ基を有する標準球をコアとし、その表面に高分子ゲルを結合させて固相化し、表面に免疫染色される相をもった正円球の陽性コントロールを作成することとした。生体にはない正円球の形態は、画像解析でそれを陽性コントロールと認識するのに非常に適している。標準球はシリカが原料のものを用いるが、これも免疫染色中にスライドグラスから剥離する可能性が示唆されたため、シランコーティングスライドグラスを用いて検討を進めている。
今後は、これらの最適条件を設定し、実際の乳癌組織を用いて陽性コントロールとしての実施が可能かを検討していく。工学面では指導者である川口氏に、病理検討では当院病理医の南條氏に指導を仰ぐ。