間葉系幹細胞を用いた転写因子制御による肝虚血再灌流障害の新たな治療法の開発

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K19897
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 高須 千絵 徳島大学, 病院, 助教 (70582823)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: Nrf2 / ADSCs / I/RI

Outline of Annual Research Achievements

29年度は細胞レベルでの肝虚血再灌流障害(I/RI)治療としてAdipose tissue derived stem cells (ADSCs)の全身投与による肝障害保護効果を確認するために in vitroにおけるADSCsによる肝細胞保護効果とNrf2 pathway関連解明を行った。肝細胞株をADSCs と細胞接触のない状態でTranswell で共培養し、肝細胞のCell Viabilityとともに、confocal microscopyによる活性化Nrf2 (nuclear translocation)、HSP(HO-1)発現、抗酸化酵素発現(SOD, prdx1)、metaboksim (ATP/ADP)、NO関連因子(eNOS, iNOS)、apoptosis (TUNEL染色、caspase 3発現)、培養液中の各種サイトカイン(IL-1. IL-6、TNF-α、Nf-kb)を非共培養群と経時的に追跡比較しており、現在I/RIの至適実験条件につき検討中である。(Group)1. Normoxic conditions A. Hepatocyte + PBS　　B. Hepatocyte + ADSC　2. Hypoxic conditions A. Hepatocyte + PBS　B. Hepatocyte + ADSC（Protocol）1. 肝細胞培養：6-well dishes at 50x104 cells/well, overnight.2.　①　ADSC 10x104 cells/well ②PBS (control)3. 低酸素chamberで培養　5% CO2, 21% O2, balanced with N2 (95% humidity)4.　Normoxic conditions　chamberをクランプし90分
Hypoxic conditions 5% CO2 and 95% N2 at 0.1-0.13 Mpa for 4 minutes (100L)、シールして90分　5. 開放し24時間培養（Parameters）1. IF ( confocal microscopy): nuclear translocation of Nrf2
2. Cell viability: 3x104 cell　3. ROS assay kit (ABCAM): 3x104 cell　4. WB (Nrf2 nucleus): 500x104 cell　5. RT-PCR: 30x104 cell Anti-oxidant expression (HO-1, CAT) Inflammatory (Nfk-b, TNF-a)6. MDA

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

in vitroにおける至適条件の検索に時間を要している

Strategy for Future Research Activity

in vitroでの結果を確認次第、肝I/RI modelを用いたADSCs投与による肝保護作用とNrf2 pathwayの関連の検討を行う予定である。
8週齢雄性 balb/c nu-nu mouseにADSCS 1.0×105を経静脈的に投与し、全肝15分間虚血後に再灌流後、2・4・6・12・24・48時間後に犠死させ血液・肝組織を採取する。検討項目；1.肝組織中のADSCsのlocation確認(IF)。2.肝重量再生率、PCNA labeling index、BrdU labeling index。3.肝障害評価：血清肝機能（AST/ALT/LDH/T-bil）、肝障害score (HE stain: Suzuki’s score)。4.Nrf2活性化評価: IF (confocal microscopeによるnuclear translocationの確認)WBによるnucleus Nrf2のADSCs投与による継時的発現増強の確認。5.酸化障害評価：血性、肝組織中MDA定量。6.HSP、抗酸化酵素発現の検討：Nrf2のtarget geneであるHSP(HO-1)発現、抗酸化酵素発現(SOD, prdx1)を遺伝子、蛋白レベルで検討する(qRT-PCR, WB, IHC)。7.Apoptisus評価：肝組織のapoptotic index (TUNEL染色)、caspase-3のqRT-PCR, WBを行う。8.Metabolism：肝組織中ATP/ADP比 (ELISA)。9.各種炎症mediator：各種サイトカイン(IL-1. IL-6、TNF-α、Nf-kb)、MPOをELISAで評価。また肝組織のIHC(CD11b、Gr-1、CD8、CD4)により浸潤細胞の評価を行う。

Causes of Carryover

（理由）
計画書作成時に購入予定であった消耗品の価格変動のため
（使用計画）
次年度への繰越額は消耗品に使用予定である