Establishment of culture and drug sensitivity test system of circulating tumor cell by biomaterial coating

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K19925
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 三宅 祐一朗 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (80724260)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 大腸癌 / 血液循環癌細胞 / 単細胞遺伝子解析

Outline of Annual Research Achievements

CTC検出器を用いて大腸癌のCTCが検出可能かどうかを調べるため、スパイク試験による性能評価を行った。Healthy donor血３mlに大腸癌細胞株（HT２９）１２,２３,７２個を加えて、CTC検出器を用いて計測したところ、検出率は約７５％であった。検出した細胞が真に癌細胞であることを証明するためには、その細胞の遺伝子変異を確認する必要がある。同検出器を用いて４つの大腸癌細胞株（DLD－１,HCT１１６,HT２９,RKO）誘電泳動力にて1細胞ずつを微細孔にいれこみ、これをマイクロマニュピレータにて採取した。その後、大腸癌細胞株の単細胞の遺伝子変異解析を行った。複数の方法で全ゲノム増幅実験を行い、最も安定した方法を確立した後に、KRAS,BRAF,PIK3CA領域のPCRを行いサンガーシーケンスにて変異解析を行った。シーケンスは高確率で可能であり、遺伝子変異も既存の報告と同じ結果であり単細胞遺伝子変異解析手法は確立されたと考えられた。次に大腸癌患者２４名の血液よりCTCを採取し遺伝子変異解析を行った。２４例中１４例にCTCと思われる細胞を検出し、合計３４細胞を単細胞にて採取した。そのうち、２０細胞はサイトケラチン陰性の細胞であった。それらの遺伝子変異解析をKRAS,BRAF,PIK3CAにて行ったところKRAS変異（G１３S）を1細胞に、PIK3CA変異(H１０４７R)を４細胞に認めた。サイトケラチン陰性の細胞のうち、２細胞に変異を認めた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでの結果はサイトケラチン陰性のような上皮系マーカーが消失している細胞でも、癌細胞が含まれているということの証明になったという意味で意義深く、血液循環癌細胞をEpCAMなどの上皮細胞マーカーだけで単離する従来の検出方法を見直さなければならないということを示唆する。単離した細胞が真に癌細胞かどうかを決定するために単一細胞遺伝子解析はパワフルな手法であり、本研究で確立した方法は、大腸癌のみならず多種の癌に応用可能である。

Strategy for Future Research Activity

今後はEpCAMに加えて間葉系細胞マーカーも加えて、大腸癌患者血液よりCTCの単離をおこない、採取した細胞を培養する条件についても最適化して、研究を遂行していく。