食道幹細胞を用いた食道の再生

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K19933
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 西野 豪志 徳島大学, 病院, 助教 (80645193)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 食道幹細胞 / 食道再生 / iPS細胞 / 遺伝子解析

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、食道疾患に対する食道再建手術において、正常臓器を犠牲にした再建ではなく、再生医療の手法を用いて食道を再生・再建することを最終目標として掲げ、細胞ソースとして、局所の幹細胞である食道幹細胞を、「足場」として脱細胞化した食道を用いることで、食道全層の再生が可能なのではないかと考えている。平成28年は、マウス食道から食道幹細胞を単離、同定する手技を確立するために、手技を繰り返し行っている。Maghsoudlouらの方法（Pediatr Surg Int 2014）に準じて、マウスをCO2吸入によりsacrificeし，頸部から腹部食道までに皮膚切開をおき、気管・気管支・心臓と一塊として摘出する．PBS/AAにて洗浄し，食道を全長に渡り長軸切開し，再度PBS/AAで洗浄する.Dispase I＋1% AAで15分間・37℃で培養させた後，粘膜下層から粘膜層のみを分離・細切し，0.05% trypsin/EDTA＋1% AAで10分間・37℃で培養する．上清を除去し，8mlのsoybean trypsin inhibitor含PBSで懸濁する．40μmのフィルターを通した後，188g・5分間・4℃で遠心分離した後，K-SFM+ mediumと懸濁する．再度遠心分離し，200μLのstaining buffer (SB)で懸濁し，CD34-PE (1:100, 4℃・30分)で染色する．コントロールとして，マウスの大腿骨から採取した骨髄細胞を用いる. 大腿骨から1ml注射器で骨髄を採取し，1mlのPBSでフラッシュする．70μmのフィルターを通し，188g・5分間・4℃で遠心分離し，氷中に保存．200μLのSBで懸濁し，CD34で染色する(BM+ control)．FACSでCD34抗体陽性細胞をソーティングし，これを食道幹細胞とする．食道を切除する手技を習熟し、より正確に幹細胞のみを同定できるよう手技を完成させつつある。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

動物実験に費やすまとまった時間が取れず、細かな手技の確認作業を繰り返している。手技が確立されたら、まとまった時間をとって次の段階に進みたい。

Strategy for Future Research Activity

動物実験に費やすまとまった時間を確保し、実験を行う人手を確保する。

Causes of Carryover

手技を習得し、実践するにあたりかなりの時間を要したため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

残額は、研究員の雇用や実験動物の購入などに使用を予定している。