大腸癌における、エピジェネティクスを標的とした新規分子標的治療薬の検討

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K19943
• Research Institution: Japanese Foundation for Cancer Research
• Principal Investigator: 徳永 竜馬 公益財団法人がん研究会, 有明病院 消化器外科, 医員 (20594881)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: JMJD3 / 大腸癌 / マイクロRNA / 細胞周期 / 血管新生 / 上皮間葉転換 / 化学療法

Outline of Annual Research Achievements

Jumonji-domain containing 3 (JMJD3) はEnhancer of Zeste Homolog 2（EZH2）が特異的にメチル化するヒストン3リジン27(H3K27)の脱メチル化酵素であり、p16INK4aを再活性化させることでがん細胞の増殖を抑制することが報告されている。近年ではglioblastoma細胞において、JMJD3強制発現による細胞増殖抑制が報告される一方で、腎細胞癌では上皮間葉転換を引き起こすとの報告があり、癌における役割はいまだ不明である。ポリコーム複合体を構成するポリコーム蛋白の一つであるEZH2は、癌抑制遺伝子や細胞周期関連遺伝子の発現を抑制することにより、癌の発育・進展に関与することが報告されている。我々は、胆管癌や膵癌においてEZH2高発現が予後不良因子である事を報告しており、大腸癌においてもスタチンがEZH2を介して細胞増殖を抑制することを報告してきた。一方、JMJD3が大腸癌患者において正常部で高発現であり、その大腸癌局所での低発現は予後不良因子であること、および癌抑制遺伝子p15INK4bを制御し大腸癌進展を抑制するメカニズムを初めて明らかにした。また、近年では各癌腫においてマイクロRNAによるエピジェネティックな遺伝子発現制御機構の関与が明らかにされつつあり、我々も同手法を用いてJMJD3の上流に存在し、JMJD3を抑制しうるマイクロRNAを検出した。本研究では、大腸癌におけるJMJD3の更なる標的遺伝子、およびJMJD3の発現を制御するマイクロRNAの同定、およびその関連を検証することを目的とした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度はマイクロRNAの結果から2種類のmiRを検出し、in vitroにてJMJD3を抑制するmiRとしてmiR186-5pを同定した。大腸癌細胞株においてmiR186-5pを強制発現させたところ、JMJD3の発現およびCDH1、VASH1、TFAP2Eといった大腸癌における重要な遺伝子の発現抑制を確認できたため、現在、in vitroにて細胞周期、上皮間葉転換および化学療法耐性の現象変化に関してmiR186-5pが及ぼす影響を検討中である。大腸癌各細胞株においてmiR186-5p、JMJD3、p15INK4b、CDH1、VASH1、TFAP2Eの発現量を確認し、最適な細胞株を選択した。過剰発現を行い、controlと比較することで現象の変化 (MTT assay、sphere formation assayにて増殖能、invasion assayにて浸潤能、time lapse imaging systemにて遊走能、等)を確認中である。また、PI染色・AnnexinⅤ染色・FACS解析を行うことで、miR186-5pがアポトーシスおよび細胞周期に与える影響を検討した。さらに、当科保有の臨床サンプルを用いて同遺伝子群の発現レベルを調べており、基礎的な解析結果が実際の癌組織において同様な遺伝子プロファイルを示すかどうかを確認している。当科におけるデータベースを充実させ、miR186-5pの臨床検体における予後との相関や、TFAP2E発現と5-FUの実臨床での効果との相関等を検討することで、ヒト臨床検体における発現意義を確認する予定である。以上より、実験は概ね順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究においては、同定したマイクロRNAが現象へ与える影響をin vitroの実験を用いてさらに検証し、ヒト臨床検体におけるmiR186-5p及びターゲット遺伝子の発現意義の確認を行う。
1.大腸癌進展におけるmiR186-5pおよび CDH1、VASH1、TFAP2Eの機能解析
現在、当科保有の大腸癌細胞株を用いてmiR186-5pの過剰発現実験を施行している。miR186-5p過剰発現ベクターをトランフェクションし、control と比較することでその機能解析を行う(具体的には上記の実験を施行している)。また、マイクロRNA InhibitorによるmiR186-5pの抑制を行うことで、その逆の変化の誘導が可能かどうかを検証する。
2.ヒト臨床検体におけるmiR186-5p及びターゲット遺伝子の発現意義の確認
熊本大学医学部付属病院での2005年～2015年における大腸癌原発切除症例及び化学療法施行症例、約1000例の臨床サンプルを準備中である。ホルマリン固定パラフィン包埋切片(切除標本及び生検標本)および凍結切片から、total RNAを抽出し、miR186-5pの発現を確認する。また、miR186-5p発現と、予後、化学療法の奏功度及び臨床病理学的因子との関係を比較検討し、miR186-5pが持つ臨床的意義を検討する。更に、同様の検体を用いてp15INK4b/CDH1/VASH1/ TFAP2EのmRNA及びタンパクレベルでの発現測定を行い、miR186-5pやJMJD3(論文発表済みのデータを含めて)の発現量との比較を行い、臨床検体における相関性を確認する。これによりin vitroでの実験結果をヒトにおいて確認することが出来る

Causes of Carryover

医局内保管の試薬等消耗品を使用できたため。また、研究代表者異動に伴い、研究環境整備に時間を要したため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

研究費は主に試薬等の消耗品購入費に充てる。他、研究結果の集約や関係書類の保管・整理等を行ってもらう事務補佐員の雇用経費に充てる予定である。

Research Products

• [Journal Article] Cancer-related multiple brain infarctions caused by Trousseau syndrome in a patient with metastatic colon cancer: a case report. (2016)
  • Author(s): Akiyama T, Miyamoto Y, Sakamoto Y, Tokunaga R, Kosumi K, Shigaki H, Kurashige J, Iwatsuki M, Baba Y, Yoshida N, Baba H
  • Journal Title: Surg Case Rep. Volume: 2(1) Pages: 91
  • DOI: 10.1186/s40792-016-0217-7.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prognostic and clinical impact of PIK3CA mutation in gastric cancer: pyrosequencing technology and literature review. (2016)
  • Author(s): Harada K, Baba Y, Shigaki H, Ishimoto T, Miyake K, Kosumi K, Tokunaga R, Izumi D, Ohuchi M, Nakamura K, Kiyozumi Y, Kurashige J, Iwatsuki M, Miyamoto Y, Sakamoto Y, Yoshida N, Watanabe M, Baba H.
  • Journal Title: BMC Cancer. Volume: 16 Pages: 400
  • DOI: 10.1186/s12885-016-2422-y.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prognostic and clinical impact of sarcopenia in esophageal squamous cell carcinoma. (2016)
  • Author(s): Harada K, Ida S, Baba Y, Ishimoto T, Kosumi K, Tokunaga R, Izumi D, Ohuchi M, Nakamura K, Kiyozumi Y, Imamura Y, Iwatsuki M, Iwagami S, Miyamoto Y, Sakamoto Y, Yoshida N, Watanabe M, Baba H.
  • Journal Title: Dis Esophagus. Volume: 29(6) Pages: 627-33
  • DOI: 10.1111/dote.12381.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tumor/normal esophagus ratio in (18)F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography/computed tomography for response and prognosis stratification after neoadjuvant chemotherapy for esophageal squamous cell carcinoma. (2016)
  • Author(s): Izumi D, Yoshida N, Watanabe M, Shiraishi S, Ishimoto T, Kosumi K, Tokunaga R, Taki K, Higashi T, Harada K, Miyata T, Ida S, Imamura Y, Iwagami S, Baba Y, Sakamoto Y, Miyamoto Y, Yamashita Y, Baba H
  • Journal Title: J Gastroenterol. Volume: 51(8) Pages: 788-95.
  • DOI: 10.1007/s00535-015-1150-4.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Neutrophil/lymphocyte ratio predicts the prognosis in esophageal squamous cell carcinoma patients. (2016)
  • Author(s): Kosumi K, Baba Y, Ishimoto T, Harada K, Nakamura K, Ohuchi M, Kiyozumi Y, Izumi D, Tokunaga R, Taki K, Higashi T, Miyata T, Kurashige J, Hiyoshi Y, Iwagami S, Sakamoto Y, Miyamoto Y, Yoshida N, Watanabe M, Baba H.
  • Journal Title: Surg Today Volume: 46(4) Pages: 405-13
  • DOI: 10.1007/s00595-015-1197-0.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] APOBEC3B is an enzymatic source of molecular alterations in esophageal squamous cell carcinoma. (2016)
  • Author(s): Kosumi K, Baba Y, Ishimoto T, Harada K, Nakamura K, Ohuchi M, Kiyozumi Y, Izumi D, Tokunaga R, Taki K, Higashi T, Miyata T, Shigaki H, Kurashige J, Hiyoshi Y, Iwatsuki M, Iwagami S, Sakamoto Y, Miyamoto Y, Yoshida N, Oki E, Watanabe M, Baba H
  • Journal Title: Med Oncol. Volume: 33(3) Pages: 26
  • DOI: 10.1007/s12032-016-0739-7.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Omental flap after pelvic exenteration for pelvic cancer. (2016)
  • Author(s): Miyamoto Y, Akiyama T, Sakamoto Y, Tokunaga R, Ohuchi M, Shigaki H, Kurashige J, Iwatsuki M, Baba Y, Yoshida N, Baba H
  • Journal Title: Surg Today Volume: 46(12) Pages: 1471-1475
  • DOI: 10.1007/s00595-016-1348-y
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Orbital Apex Syndrome Caused by Invasive Aspergillosis as an Adverse Effect of Systemic Chemotherapy for Metastatic Colorectal Cancer: a Case Report. (2016)
  • Author(s): Miyamoto Y, Sakamoto Y, Ohuchi M, Tokunaga R, Shigaki H, Kurashige J, Iwatsuki M, Baba Y, Yoshida N, Watanabe M, Baba H
  • Journal Title: Anticancer Res. Volume: 36(2) Pages: 821-3
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Retroileal colorectal anastomosis after extended left colectomy: application for laparoscopic surgery. (2016)
  • Author(s): Sakamoto Y, Tokunaga R, Miyamoto Y, Ohuchi M, Nakamura K, Kosumi K, Harada K, Shigaki H, Kurashige J, Iwatsuki M, Baba Y, Yoshida N, Baba H
  • Journal Title: Surg Today. Volume: 46(12) Pages: 1476-1478
  • DOI: 10.1007/s00595-016-1313-9
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fibroblast growth factor receptor 2 expression, but not its genetic amplification, is associated with tumor growth and worse survival in esophagogastric junction adenocarcinoma. (2016)
  • Author(s): Tokunaga R, Imamura Y, Nakamura K, Ishimoto T, Nakagawa S, Miyake K, Nakaji Y, Tsuda Y, Iwatsuki M, Baba Y, Sakamoto Y, Miyamoto Y, Saeki H, Yoshida N, Oki E, Watanabe M, Oda Y, Bass AJ, Maehara Y, Baba H
  • Journal Title: Oncotarget. Volume: 7(15) Pages: 19748-61.
  • DOI: 10.18632/oncotarget.7782.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The Prognostic Significance of Histone Lysine Demethylase JMJD3/KDM6B in Colorectal Cancer. (2016)
  • Author(s): Tokunaga R, Sakamoto Y, Nakagawa S, Miyake K, Izumi D, Kosumi K, Taki K, Higashi T, Imamura Y, Ishimoto T, Iwatsuki M, Baba Y, Miyamoto Y, Yoshida N, Oki E, Watanabe M, Baba H
  • Journal Title: Ann Surg Oncol Volume: 23(2) Pages: 678-85
  • DOI: 10.1245/s10434-015-4879-3.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Duration of Smoking Cessation and Postoperative Morbidity After Esophagectomy for Esophageal Cancer: How Long Should Patients Stop Smoking Before Surgery? (2016)
  • Author(s): Yoshida N, Baba Y, Hiyoshi Y, Shigaki H, Kurashige J, Sakamoto Y, Miyamoto Y, Iwatsuki M, Ishimoto T, Kosumi K, Sugihara H, Harada K, Tokunaga R, Izumi D, Watanabe M, Baba H
  • Journal Title: World J Surg Volume: 40(1) Pages: 142-7
  • DOI: 10.1007/s00268-015-3236-9.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Preoperative Nutritional Assessment by Controlling Nutritional Status (CONUT) is Useful to estimate Postoperative Morbidity After Esophagectomy for Esophageal Cancer. (2016)
  • Author(s): Yoshida N, Baba Y, Shigaki H, Harada K, Iwatsuki M, Kurashige J, Sakamoto Y, Miyamoto Y, Ishimoto T, Kosumi K, Tokunaga R, Imamura Y, Ida S, Hiyoshi Y, Watanabe M, Baba H
  • Journal Title: World J Surg Volume: 40(8) Pages: 1910-7
  • DOI: 10.1007/s00268-016-3549-3.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Risk factors of early recurrence within 6 months after esophagectomy following neoadjuvant chemotherapy for resectable advanced esophageal squamous cell carcinoma. (2016)
  • Author(s): Yoshida N, Baba Y, Shigaki H, Harada K, Iwatsuki M, Sakamoto Y, Miyamoto Y, Kurashige J, Kosumi K, Tokunaga R, Watanabe M, Baba H
  • Journal Title: Int J Clin Oncol Volume: 21(6) Pages: 1071-1078
  • DOI: 10.1007/s10147-016-0994-9
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effect of Esophagus Position on Surgical Difficulty and Postoperative Morbidities After Thoracoscopic Esophagectomy. (2016)
  • Author(s): Yoshida N, Baba Y, Shigaki H, Shiraishi S, Harada K, Watanabe M, Iwatsuki M, Kurashige J, Sakamoto Y, Miyamoto Y, Ishimoto T, Kosumi K, Tokunaga R, Yamashita Y, Baba H
  • Journal Title: Semin Thorac Cardiovasc Surg Volume: 28(1) Pages: 172-9
  • DOI: 10.1053/j.semtcvs.2015.12.002.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Incidence and risk factors of synchronous colorectal cancer in patients with esophageal cancer: an analysis of 480 consecutive colonoscopies before surgery. (2016)
  • Author(s): Yoshida N, Tamaoki Y, Baba Y, Sakamoto Y, Miyamoto Y, Iwatsuki M, Shono T, Miyamoto H, Imuta M, Kurashige J, Sawayama H, Tokunaga R, Watanabe M, Sasaki Y, Yamashita Y, Baba H
  • Journal Title: Int J Clin Oncol Volume: 21(6) Pages: 1079-1084.
  • DOI: 10.1007/s10147-016-1015-8
  • Peer Reviewed
• [Presentation] miR 186-5p はヒストン脱メチル化酵素JMJD3/KDM6Bの抑制を介し大腸癌における腫瘍増殖を促進させる (2016)
  • Author(s): 徳永 竜馬、坂本 快郎、大内 繭子、中村 健一、 美馬 浩介、澤山 浩、木下 浩一、辛島 龍一、 岩槻 政晃、馬場 祥史、宮本 裕士、吉田 直矢、 馬場 秀夫
  • Organizer: 第27回日本消化器癌発生学会総会
  • Place of Presentation: 城山観光ホテル（鹿児島県）
  • Year and Date: 2016-09-16 – 2016-09-16