2016 Fiscal Year Research-status Report
臨床応用を目的とした膵癌リンパ管新生メカニズムの解明
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16K19947
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
齊藤 健太 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (10770240)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 膵癌 / リンパ管新生 / K-ras mutation / VEGF-C |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膵癌のリンパ節転移メカニズムの解明は十分とはいえない．その理由として，(a)リンパ管内皮細胞の分離培養法が確立されていなかった，(b)免疫染色で用いる抗リンパ管内皮細胞抗体の特異性が必ずしも高くなかった点などがあげられる．しかしながら近年，リンパ管内皮細胞の分離継代培養が可能になり，VEGF-CやVEGF-Dといったリンパ管新生増殖因子も同定された．また，リンパ管内皮細胞に特異性の高い抗体も確立された．これらをもとにリンパ節転移能の異なる膵癌細胞株の分子生物学的特徴を検討し，抗リンパ節転移治療の確立を目的として平成２８年度は以下の研究を行った．(1)膵癌細胞株を定量PCRを用いてVEGF-CのmRNA発現量の差異を比較検討した(2)同様に膵癌細胞株の培養上澄を用いてELISAでVEGF-C蛋白の発現量の差異を検討した．これらより，膵癌細胞株をVEGF-C強発現株(MIA PaCa-2)と低発現株(BxPC-3)に分類した．(2)膵癌細胞株とリンパ管上皮細胞，線維芽細胞をdouble chamberを用いて約2週間共培養し，リンパ管上皮細胞に特異的に反応するpodoplanin抗体を用いてリンパ管上皮細胞を染色し，リンパ管上皮細胞の管腔形成を比較した．VEGF-C低発現株に比べVEGF-C高発現株との共培養で，リンパ管新生は亢進していることが確認できた．これらより，膵癌においてもVEGF-Cがリンパ管新生に強く関与していることが明らかとなった．次にVEGF-C発現を制御する上流シグナルを検討するために，K-ras突然変異に着目した．MIA PaCa-2はK-ras点突然変異を認めるが，BxPC-3はK-ras点突然変異を認めない．VEGF-Cの発現を制御するシグナルの解明はされていないため，今後は膵癌の９０％に認めるK-ras点突然変異に着目してリンパ管新生を検討することも行う予定である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
膵癌細胞株をVEGF-C高産生株(MIA-PaCa-2)とVEGF-C低産生株(BxPC-3)に分類した．独自のin vitro lymphangiogenesis assayを用いてリンパ管新生能に差があることを確認した．膵癌細胞を線維芽細胞とリンパ管上皮細胞と共培養してリンパ管新生能を検討するアッセイは教室オリジナルである．しかしながら当初の計画よりもやや遅れており，VEGF-DやKras点突然変異とリンパ管新生の関係を検討し，動物実験を行っていく．
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| Strategy for Future Research Activity |
VEGF-DやKras点突然変異とリンパ管新生の関係を検討し，動物実験を行っていく．
(3)VEGF-Cと同様に，定量PCRおよびELISAで膵癌細胞株のVEGF-Dの発現を比較検討し，高VEGF-D発現株，低VEGF-D発現株に分類する．In vitro lymphangiogenesis assayで両群のリンパ管新生能を比較検討する．
(4) K-Ras癌遺伝子の活性化とリンパ管新生刺激因子産生との関連の検討 4-1．正常膵管上皮細胞(HPDE) と K-Ras4BG12V導入 HPDE 株(HPDE-KRas) を用いて，活性化K-RasがVEGF-CおよびVEGF-Dの産生を増加することを確認する．4-2．WB でK-Rasの活性化がリンパ管新生に関わる下流シグナルを検索する．
(5) 膵癌細胞株のリンパ管新生能およびリンパ節転移能の検討（in vivo）
膵癌細胞をヌードマウスに同所性移植し，腫瘍周囲および腫瘍内リンパ管新生を観察する．また，リンパ管新生とリンパ節転移の相関性を評価する．
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Research Products
(10 results)
