2016 Fiscal Year Research-status Report
滑膜における14番染色体microRNA clusterの機能解明
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16K20038
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
田中 陽子 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 日本学術振興会特別研究員 (40647434)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 関節リウマチ / microRNA / 滑膜 / 滑膜細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
MicorRNA（miRNA）の関節リウマチ（RA）の病態における機能を明らかにし、治療・診断に発展させる土台を築くことが目的である。2008年以降、コントロール群と比較してRAの滑膜や末梢血単核球に特異的に発現しているmiRNAがいくつか報告されているが、これらのmiRNAのRAにおける機能は未だに明らかになっておらず、各々のmiRNAターゲット遺伝子の実験的な特定もようやく世界中のデータがまとめられ始めたところである。本研究ではmiR-379/410クラスターのRAにおける機能を明らかにするとともに、自己免疫性疾患のmiRNAの役割を解析する技術の開発を行う。
平成28年度はmiR-379/410クラスターにおいてRA滑膜にて発現の低下しているものについて解析を行った。クラスターに含まれるmiRNAのうち次世代シークエンシングとmiRNA microarrayのデータに共通してRA滑膜にて発現の低下したものは3種類得られている。このうち1種類は発現ベクターにより滑膜細胞に発現を誘導すると細胞増殖や細胞遊走を抑制することが明らかとなり、関節炎動物モデルにおいてもmiRNA mimicを投与することにより治療効果を示した。現在、このmiRNAのターゲット遺伝子を特定するためにハイスループットルシフェラーゼアッセイを用いて数種類のターゲット遺伝子が候補にあがっており、滑膜細胞においてこれらの遺伝子をノックダウンすることによりmiRNA発現実験と同じ効果が得られるかどうかを検証中である。
関節炎動物モデルにおいて治療効果の得られたmiRNAの報告はまだ少なく、関節炎の病態とmiRNAの関係のさらに詳しいメカニズムを解析していく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
miR-379/410クラスターに含まれ、RA滑膜にて発現の低下した3つのmiRNAに注目して研究を行っている。そのうちの1つのmiRNAの機能は明らかになったため、そのターゲット遺伝子の特定を行っている。具体的には5000遺伝子のレポーターベクターを384 wellに滴下し、miRNA発現ベクターとトランスフェクション試薬、細胞の順に滴下し、ルシフェラーゼアッセイを行った。過剰発現によりルシフェラーゼ活性の低下したもののうち、それぞれ低下率上位の遺伝子259個を抽出した。さらに384 wellを用いて259遺伝子について4回ルシフェラーゼアッセイを行い、2回以上同じ傾向が得られた遺伝子を52個抽出した。次にスケールをアップし、96 wellにて同様の結果が得られた遺伝子を23個抽出した。23遺伝子のうち、滑膜細胞を用いた実験でmiRNA過剰発現により発現が低下している遺伝子は17遺伝子ある事が明らかとなった。遺伝子AについてはmiRNAにより発現が抑制されることによって細胞増殖に影響を与えている事が明らかとなり、遺伝子BについてはmiRNAにより発現が抑制されることによって細胞増殖に影響を与えていることが明らかとなっている。以上の結果より、おおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの結果を論文として報告する予定である。本研究にて注目しているmiRNAクラスターは転写されたRNAの構造上、ノックアウトが難しいと考えられるが、ノックアウトした細胞や動物を用いた解析を進めていきたい。
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| Causes of Carryover |
本年度におけるハイスループットスクリーニング等の実験が研究室内の他のプロジェクトと一括して行うことができたため、その分の余剰が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
動物モデル等、高額が見込まれる実験の物品購入に使用する。
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