遺伝子導入脂肪由来幹細胞を用いた脊髄損傷治療効果の検証

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K20043
• Research Institution: University of Fukui
• Principal Investigator: 高橋 藍 福井大学, 学術研究院医学系部門(附属病院部), 助教 (90615303)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 遺伝子導入脂肪由来幹細 / 脊髄損傷治療 / 酸化ストレス

Outline of Annual Research Achievements

本研究では２種類のMSC，即ちADSC (adipose-derived mesenchymal stem cell) およびBMSC (bone-marrow derived mesenchymal stem cell) を用いて，治療効果のメカニズム解析に主眼を置き，①DNAマイクロアレイによるマウスADSCとBMSCとの比較解析と治療責任遺伝子Xの決定，②標的遺伝子Xを導入したX-overexpressing ADSCを用いた治療効果解析，の２課題の評価を行うことを目的とする．
これまでの研究においては，同一マウスより分離・培養したADSCおよびBMSCを用いて，マイクロアレイ法によりADSCとBMSCの遺伝子発現の網羅的解析を行った．また，マイクロアレイ法で変動のあったいくつかの主要な遺伝子については，ADSC，BMSCを低酸素条件および通常酸素濃度下に培養し，低酸素による遺伝子発現の変化について検討をすすめており，国内の学会で発表を行った（2016年日本整形外科学会基礎学術集会，2017年脊椎脊髄病学会，2017年中部日本整形外科災害外科学会）．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

①マウス脂肪由来幹細胞（ADSC）および骨髄間葉系幹細胞（BMSC）の分離・培養
・8週齢のC57BL/6JマウスよりADSC,BMSCを分離し，10%FBS含有DMEMで初代培養を7日間行い,それを第0継代と定義し，第1-5継代のADSCを冷凍保存して実験に用いている．
②DNAマイクロアレイによるADSCとBMSCの遺伝子比較解析およびストレス下での遺伝子発現の変化
・マウスADSCおよびBMSCを10%FBS含有DMEMで上記の方法で継代培養し，DNAマイクロアレイ法で網羅的解析を行い，2種の細胞の遺伝子発現について比較検討を行った．
・低酸素条件下でのADSCとBMSCとの遺伝子発現比較
マイクロアレイ法で変動のあった遺伝子のうち，主要なものについて，マウスADSCおよびBMSCを20.5%酸素条件および0.1%酸素条件にてそれぞれ培養し，rt-PCR法にて2種の細胞の遺伝子発現について比較検討を行った．

Strategy for Future Research Activity

①責任遺伝子X-overexpressing ADSCを用いた治療効果の検討
・X-overexpressing ADSCの作成
上記で明らかにされた責任遺伝子X（即ちBMSCとの比較で有意差があり，脊髄損傷治療効果を有すると考えられるもの）について，遺伝子組み換えADSCを作成する．責任遺伝子XをADSCに形質導入し使用する.
②脊髄損傷モデルの作成と治療効果の検討
・C57BL6/JマウスまたはThy1-YFPマウスを麻酔下に第9-10胸椎を椎弓切除し, IH impactorを用いて胸髄硬膜上より60 kdyneの圧挫を加え，遺伝子組み換えADSC移植群，コントロール群を作成する．
・上記のグループについて運動機能改善効果の検証（行動学的評価），軸索・髄鞘再生効果の検証（蛍光免疫染色，LFB染色），血管新生効果（蛍光免疫染色），アポトーシス抑制効果（フローサイトメトリー）について定量評価を行う．

Causes of Carryover

補助事業の誠実な執行に努めた結果、当初計画より経費の使用が節約できたことにより未使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当該未使用額を次年度に持ち越して追加の試薬・抗体・消耗品等購入する。