ヒト及びカニクイザル多能性幹細胞を用いた腎尿路再生の研究

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K20131
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 小林 憲市 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (40727434)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: カニクイザル / 多能性幹細胞 / 腎臓

Outline of Annual Research Achievements

まずはカニクイザルES細胞での下記実験をおこなった。
ES細胞の腎臓への分化過程を細胞が生存した状態で確認し、集積するためにはレポーターが必要である。我々はまず、カニクイザルES細胞に対する遺伝子改変システム、つまりターゲット遺伝子にレポーターをノックインする手法の確立を行った。
まず、腎臓の分化において比較的長期間高発現するOSR1遺伝子をターゲットにレポーター遺伝子（GFP）のノックインを行った。293FTにTaget遺伝子を挿入したpCAG-EGxxFPプラスミドを用いてCRISPR/Cas9システムのシュミレーションを行いFACSにて十分な蛍光を発することを確認した。遺伝子改変したノックインES細胞はGENOTYPING_PCR、SOUTHERN_BLOTTINGにて適切なのノックインができていることを確認した。
つぎに分化に実験を開始した。カニクイザルES細胞はヒトのiPS細胞と同様にPrime型であったため、ヒトの研究結果そのまま適応されるかと思われたが、その性質が我々が想定したものから大きく異なっていることが本年の研究でわかった。分化誘導にかける時間、各因子の濃度の調整を行い、よりヒトに近い形での分化条件の設定に成功した。来年度はカニクイザルES細胞のみならず、iPSでも同様の分化条件の確認を行い、免疫寛容が成立する多能性幹細胞を個体移植するプトロコールの作成を行う予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

カニクイザルES細胞はヒトのiPS細胞と同様にPrime型であったため、ヒトの研究結果そのまま適応されるかと思われたが、Publish　Dataにそって同様のプロトコルで行うと、まったく異なる強度を示していた。よって、分化の条件そのものを、カニクイザル多能性幹細胞で設定しなければならなくなり、分化条件の検討に想定外の時間を要している。

Strategy for Future Research Activity

年度終盤に、カニクイザルES細胞での分化条件がある程度かたまったため、今後は設定条件での分化度の定量化を行い予定である。
また、移植実験に向けて免疫寛容が成立する多能性幹細胞を用いて、分化実験を行い、条件の確認と、移植実験の準備を進める

Causes of Carryover

前述の理由で実験計画が遅れ、使用予定物品の購入が遅延していることにより使用額に差が出他理由である。
特に、移植実験用のカイニクイザルの購入と、分化誘導後の免疫染色用の抗体の購入がなかったことが、額が大きくなった要因である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

主として、免疫染色用抗体の購入、細胞維持培地、分化誘導因子、移植実験用の実験動物購入（カニクイザル・マウス）に使用する予定である。