精巣における転写因子機構の解明と男子不妊症遺伝子治療に向けた基礎的研究

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K20151
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 佐藤 雄一 福島県立医科大学, 医学部, 病院助手 (00706848)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: アデノウイルスベクター法

Outline of Annual Research Achievements

（１）マウスセルトリ細胞およびライディッヒ細胞の初代培養:昨年に引き続き、8－10週齢のICRマウスより、セルトリ細胞とライディッヒ細胞を抽出することができた。
(２)培養細胞下での精巣細胞への遺伝子導入:①カチオニックリポフェクション法：昨年と同様精子形成細胞と、セルトリ細胞とライディッヒ細胞を共培養しを用いて、昨年と条件の設定を変更し、Ad4BP/SF-1の遺伝子導入を行った。しかし、やはり本方法では、セルトリ細胞とライディッヒ細胞への遺伝子導入は不可能であり、精巣体細胞への遺伝子導入法としては不適切と考えられた。②エレクトロポレーション法：昨年と引き続き遺伝子注入濃度を含めて、条件設定を変えてはみたが、現在のところ効率的な遺伝子導入ができていない。細胞障害の程度も強く、エレクトロポレーション法では限界があると考えた。③アデノウイルスベクター法：セルトリ細胞とライディッヒ細胞への遺伝子導入方法に成功した。遺伝子導入することによりSertoli細胞分泌物質であるactivin、inhibin、plasminogen activator、cyclin protein2、NO、lactateなどの発現量を測定したところ、濃度は一過性の減少を認めたものの、遺伝子発現期間に比して短期であった。
（３）精巣内遺伝子導入:私たちがこれまでに開発した、精巣へ直接陰嚢を経由して導入する方法（精巣内直接注入法）と精巣網からマイクロガラス管を用いて逆行性に精細管内に注入する方法（精細管注入法）を用いて行った。①カチオニックリポフェクション法では、in　vitroと同様導入不可能であった。②エレクトロポレーション法、③アデノウイルスベクター法を用いて、遺伝子導入を行ったところ、②ではあらゆる細胞に、アデノウイルスベクター法ではライディッヒ細胞への遺伝子発現が確認された。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本研究では、精子形成細胞と、セルトリ細胞とライディッヒ細胞を共培養し①カチオニックリポフェクション法、②エレクトロポレーション法、③アデノウイルスベクター法を用いて、Ad4BP/SF-1およびDAX-1の遺伝子導入を行うことと、遺伝子導入後の精原細胞変化について検討することが、当初の目的であった。昨年に引き続き条件設定を変えながら行ってきたが、①カチオニックリポフェクション法、エレクトロポレーション法では、難しいと考えた。アデノウイルスベクター法は効率的な遺伝子導入が可能となりAd4BP/SF-1およびDAX-1の遺伝子導入を行うことが可能となった。
当初の予定では、アデノウイルスベクター法を用いて、Ad4BP/SF-1およびDAX-1の遺伝子導入を行った後、cDNAチップを用いてマイクロアレイによる網羅的遺伝子解析を行い、遺伝子導入による遺伝子発現の変化について併せて検討するはずであったが、上記のように様々な条件設定が必要となり、予定以上の時間を要した。

Strategy for Future Research Activity

昨年の予定に引き続き、アデノウイルスベクター法を用いて、Ad4BP/SF-1およびDAX-1の遺伝子導入を行った後、cDNAチップを用いてマイクロアレイによる網羅的遺伝子解析を行い、遺伝子導入による遺伝子発現の変化について併せて検討する。遺伝子発現の変化が明らかになったものに関しては定量的RT-PCRにより発現量を定量する。また、マウスへの遺伝子導入法を用いた転写因子Ad4BP/SF-1・DAX-1の精巣内遺伝子導入も合わせて進める。精巣への遺伝子導入方法としては、私たちがこれまでに開発した、精巣へ直接陰嚢を経由して導入する方法（精巣内直接注入法）と精巣網からマイクロガラス管を用いて逆行性に精細管内に注入する方法（精細管注入法）を用いて行う。アデノウイルスベクター法を用いて、Ad4BP/SF-1およびDAX-1の遺伝子導入を行う。
Ad4BP/SF-1およびDax-1を遺伝子導入することにより、発現量および発現期間を確認した上で造精機能への影響、ステロイド合成への影響を検討する。導入効率は、western blottingによりDax-1の発現量を観察することにより行う。造精機能への影響は、Johnsen scoreにて評価する。同時に副作用の有無を確認するために、TUNEL法によるアポトーシスの有無を検討、免疫組織化学染色によりCD4,CD8陽性細胞の発現の有無を観察し細胞性免疫反応の有無の検討、血清IgG抗体の検索による体液性免疫反応の有無を検討する。

Causes of Carryover

（理由）Ad4BP/SF-1およびDAX-1の遺伝子導入が安定して行えず、様々な条件設定下での実験が必要であったため。
（使用計画）
アデノウイルスベクター法を用いて、Ad4BP/SF-1およびDAX-1の遺伝子導入を行った後、cDNAチップを用いてマイクロアレイによる網羅的遺伝子解析を行い、遺伝子導入による遺伝子発現の変化について併せて検討し、遺伝子発現の変化が明らかになったものに関しては定量的RT-PCRにより発現量を定量する。マウスへの遺伝子導入法を用いた転写因子Ad4BP/SF-1・DAX-1の精巣内遺伝子導入も合わせて進める。Ad4BP/SF-1およびDax-1を遺伝子導入することにより、発現量および発現期間を確認した上で造精機能への影響、ステロイド合成への影響を検討する。導入効率は、western blottingによりDax-1の発現量を観察することにより行う。造精機能への影響は、Johnsen scoreにて評価する。同時に副作用の有無を確認するために、TUNEL法によるアポトーシスの有無を検討、免疫組織化学染色によりCD4,CD8陽性細胞の発現の有無を観察し細胞性免疫反応の有無の検討、血清IgG抗体の検索による体液性免疫反応の有無を検討する。