重合OPNとオートファジーの働きに着目した尿路結石予防薬開発のための基礎研究

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K20153
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 海野 怜 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 臨床研究医 (40755683)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 尿路結石 / オートファジー

Outline of Annual Research Achievements

重合OPNの検討として、追加実験としてエチレングリコールの自由引水により結石を形成させたラットで、結石モデルを作成させ重合OPNの存在を調べた。しかしながらWestern blotでは80kD以上のバンドは出ず、重合OPNの発現が見られず、結石形成過程において結石中のOPNはモノマーで存在している可能性が示唆された。
次に結石形成過程におけるオートファジーの検討として、シュウ酸Ca結晶を尿細管細胞に添加して調べた。GFP-RFP-LC3 (tfLC3) を細胞にトランスフェクションし、決勝点化による活性を評価したところ、シュウ酸Caの添加でオートファジーは早期で一時的に亢進するが、有意差は示さなかった。さらに6時間以上暴露させると有意にオートファジーが低下した。細胞内のリソソームの傷害を、酸性化障害はLysotrackerを用いて、膜障害はGalectine-3の免疫染色で検討した。結晶添加により、リソソームの酸性化障害、膜障害を認めた。これら障害リソソームは、ユビキチン化されており、オートファジーにより選択的に処理されている可能性が示唆された。
次にマウスでの結石形成過程でのオートファジーの活性を調べるため、オートファゴソーム可視化マウス（LC3 transgenic mice）を用いた。結石形成を認めるマウスではLC3のdotsが有意に低下し、透過型電子顕微鏡でも同部位に一致して、多数の傷害を受けたリソソームやミトコンドリアを認めた。
オートファジー活性の低下をしらべるため、オートファジーを上流で制御するmTOR活性と転写因子であるTFEBの発現で検討した。結石形成過程においてmTOR活性は上昇し、TFEBの核内移行が阻害されており、それによりオートファジーが低下することを見出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

In vitro, In vivo実験とも、結石形成過程において、重合OPNの発現が見られず、OPNはモノマーで存在している可能性が示唆された。そのため、OPN重合阻害薬を用いた結石予防は難しいと判断した。オートファジーの研究については順調にいっている。培養細胞・動物モデルとも、mTOR亢進とTFEBの核内移行の阻害によりオートファジーが低下することがわかった。

Strategy for Future Research Activity

mTOR亢進とTFEBの核内移行の阻害によりオートファジーが低下し、それにより結石形成が促進することがわかったため、mTOR阻害薬を用いたオートファジー活性による結石予防効果の検討を行っていく予定である。

Causes of Carryover

オートファジー制御薬による結石予防効果の検討を行うため。
また、日本泌尿器科学会総会、アメリカ泌尿器科学会での発表も採択され行う予定である。

Research Products

• [Presentation] 選択的オートファジーにより腎結石形成は抑制される (2018)
  • Author(s): 海野 怜、川端 剛、高瀬 弘嗣、内木 拓、濵本 周造、安藤 亮介、岡田 淳志、戸澤 啓一、吉森 保、安井 孝周
  • Organizer: 第27回泌尿器科分子・細胞研究会
• [Presentation] Autophagy's protective roles for kidney stone formation. (2017)
  • Author(s): Unno Rei, Sugino Teruaki, Taguchi Kazumi, Hamamoto Shuzo, Ando Ryosuke, Endo Sumio, Okada Atsushi, Sakakura Takeshi, Tozawa Keiichi, Kohri Kenjiro, Yasui Takahiro
  • Organizer: 第105回日本泌尿器科学会総会
• [Presentation] Autophagy maintains cellular homeostasis and inhibits renal crystal formation (2017)
  • Author(s): Unno Rei, Unno Naoko, Ota Yuya, Sugino Teruaki, Taguchi Kazumi, Hamamoto Shuzo, Ando Ryosuke, Okada Atsushi, Tozawa Keiichi, Kohri Kenjiro, Yasui Takahiro
  • Organizer: American Urological Association Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] オートファジー亢進により腎結石形成は制御される (2017)
  • Author(s): 海野 怜、杉野 輝明、田口 和己、藤井 泰普、濵本 周造、安藤 亮介、岡田 淳志、戸澤 啓一、郡 健二郎、安井 孝周
  • Organizer: 第60回日本腎臓学会学術総会
• [Presentation] 腎結石形成過程における選択的オートファジーの機能解析 (2017)
  • Author(s): 海野 怜、杉野 輝明、田口 和己、廣瀬 泰彦、伊藤 靖彦、濵本 周造、安藤 亮介、岡田 淳志、戸澤 啓一、郡 健二郎、安井 孝周
  • Organizer: 日本尿路結石症学会第27回学術集会