2017 Fiscal Year Research-status Report
重合OPNとオートファジーの働きに着目した尿路結石予防薬開発のための基礎研究
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16K20153
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
海野 怜 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 臨床研究医 (40755683)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 尿路結石 / オートファジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
重合OPNの検討として、追加実験としてエチレングリコールの自由引水により結石を形成させたラットで、結石モデルを作成させ重合OPNの存在を調べた。しかしながらWestern blotでは80kD以上のバンドは出ず、重合OPNの発現が見られず、結石形成過程において結石中のOPNはモノマーで存在している可能性が示唆された。
次に結石形成過程におけるオートファジーの検討として、シュウ酸Ca結晶を尿細管細胞に添加して調べた。GFP-RFP-LC3 (tfLC3) を細胞にトランスフェクションし、決勝点化による活性を評価したところ、シュウ酸Caの添加でオートファジーは早期で一時的に亢進するが、有意差は示さなかった。さらに6時間以上暴露させると有意にオートファジーが低下した。細胞内のリソソームの傷害を、酸性化障害はLysotrackerを用いて、膜障害はGalectine-3の免疫染色で検討した。結晶添加により、リソソームの酸性化障害、膜障害を認めた。これら障害リソソームは、ユビキチン化されており、オートファジーにより選択的に処理されている可能性が示唆された。
次にマウスでの結石形成過程でのオートファジーの活性を調べるため、オートファゴソーム可視化マウス（LC3 transgenic mice）を用いた。結石形成を認めるマウスではLC3のdotsが有意に低下し、透過型電子顕微鏡でも同部位に一致して、多数の傷害を受けたリソソームやミトコンドリアを認めた。
オートファジー活性の低下をしらべるため、オートファジーを上流で制御するmTOR活性と転写因子であるTFEBの発現で検討した。結石形成過程においてmTOR活性は上昇し、TFEBの核内移行が阻害されており、それによりオートファジーが低下することを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
In vitro, In vivo実験とも、結石形成過程において、重合OPNの発現が見られず、OPNはモノマーで存在している可能性が示唆された。そのため、OPN重合阻害薬を用いた結石予防は難しいと判断した。オートファジーの研究については順調にいっている。培養細胞・動物モデルとも、mTOR亢進とTFEBの核内移行の阻害によりオートファジーが低下することがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
mTOR亢進とTFEBの核内移行の阻害によりオートファジーが低下し、それにより結石形成が促進することがわかったため、mTOR阻害薬を用いたオートファジー活性による結石予防効果の検討を行っていく予定である。
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| Causes of Carryover |
オートファジー制御薬による結石予防効果の検討を行うため。
また、日本泌尿器科学会総会、アメリカ泌尿器科学会での発表も採択され行う予定である。
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[Presentation] Autophagy's protective roles for kidney stone formation.2017
Author(s)
Unno Rei, Sugino Teruaki, Taguchi Kazumi, Hamamoto Shuzo, Ando Ryosuke, Endo Sumio, Okada Atsushi, Sakakura Takeshi, Tozawa Keiichi, Kohri Kenjiro, Yasui Takahiro
Organizer
第105回日本泌尿器科学会総会
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[Presentation] Autophagy maintains cellular homeostasis and inhibits renal crystal formation2017
Author(s)
Unno Rei, Unno Naoko, Ota Yuya, Sugino Teruaki, Taguchi Kazumi, Hamamoto Shuzo, Ando Ryosuke, Okada Atsushi, Tozawa Keiichi, Kohri Kenjiro, Yasui Takahiro
Organizer
American Urological Association Annual Meeting
Int'l Joint Research
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