間葉上皮転換（MET)モデル作製とモデルを用いた生体内MET分子制御機構の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K20189
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 高尾 知佳 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任助教 (40612429)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: MET / 上皮プロモーター

Outline of Annual Research Achievements

動物成体内のMET現象は、間葉系細胞が組織浸潤を行い、再度上皮様構造を形成する状況が想定される。そこで子宮内膜症モデル動物において、発光タンパク質と蛍光タンパク質を同時に発現するレンチウイルスベクターを構築し、このレンチウイルス感染細胞を移植することで、IVISを用いて動物体内での細胞動態をリアルタイムに観察できる系を確立した。そこでMET現象をおさえる為にこのベクターのプロモーターを上皮細胞特異的プロモーターに変換し、新たなプラスミドを作成した。上皮細胞特異的プロモーターとして、Cytokeratin18（CK18）、Cytokeratin 19（CK19）、epithelial cell adhesion molecule（EpiCAM）の3種類を作成した。これらは発現のタイミングが異なると考えられるので、METを起こした際、どの上皮マーカーが最初に発現するかを考慮したものである。これらを間葉系幹細胞株UE6E7T-11細胞に感染させて現在実験を行っている。
またin vitroでのMETモデルの作成にも着手している。間葉系幹細胞誘導子宮内膜症モデル細胞を用いたマトリゲル包埋およびコラーゲンゲル包埋三次元培養法やスフェロイドを用いた上皮培養液中分化誘導法等を実践しているが、現在in vitroにおけるMETモデルの完成には至っていない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

申請者は平成28年9月より慶應義塾大学医学部産婦人科へ移動となり、移動前の1ヶ月は引継ぎや引越等で時間が割かれたこと、また着任後は赴任先の仕事を軌道に乗せることに加え、新たに若手Bの実験の基盤を作ることに時間がかかったことから、予定していた研究進捗が遅れている理由である。

Strategy for Future Research Activity

今後、作製した上皮プロモーター導入間葉系幹細胞を子宮内膜症モデル細胞へ誘導し、免疫不全マウスへ移植した細胞がMETを起こした時期を非侵襲的に観察する。また子宮内膜癌細胞等へ同様に上皮プロモーターを導入したレンチウイルスベクターを感染させ、同様の実験を行う。さらに、構築された組織から、細胞で発現している蛍光蛋白と上皮特異的な表面抗原を認識する蛍光標識抗体の組み合わせにより、セルソーターを用いて自発的にMETを起こした細胞のみを純化して回収をおこなう。赴任場所が変わったことから次世代シークエンス等の使用が可能ではなくなったが、単離した自発的MET細胞と、METを起こす前の細胞をNSGやDNAマイクロアレイ等の解析を行い、MET制御に関与する鍵因子の同定を試みる。同定したMET制御の鍵因子と予想される候補因子について、強制発現や発現抑制、また入手可能であれば機能亢進/阻害薬剤等を用いるなどの手法によって、MET制御機構への関与を明らかにする。

Causes of Carryover

進捗が遅れていることから、その中での効率的な物品調達を行った結果である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度に平成28年度行えなかった研究遂行に使用する予定である（DNAマイクロアレイやNSG,さらに免疫不全マウスの購入等）。