ヒト末梢血白血球を用いた新たな分娩予測マーカーの開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K20207
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 牧野 真太郎 順天堂大学, 医学部, 准教授 (70570894)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 早産 / 胎盤 / 白血球組織侵入アッセイ / 末梢白血球活動性

Outline of Annual Research Achievements

研究期間の前半はまず基盤研究として、①血液検体収取および保存方法、②血液検体からの白血球の精製とmRNAの抽出測定系の二つを確立すること、並行して切迫早産患者検体の採取を継続的に行うことを計画していた。
平成28年度、正常経腟分娩後に採取された40名の胎盤から採取した溶液を集め、混合することにより大きなストックを作成し、目標数を超える検体収集を行えた。
胎盤から5㎝×5㎝大の卵膜および絨毛組織の一部を採取し4mlの培養液（DMEM）と共にホモジナイズを行った。20,000G、2時間、4℃による遠心分離した上清を後述のアッセイに使用するまで-80℃で保存した。ストックを作った後に初めて白血球の採取を始め、その都度アッセイを施行するため、血液と胎盤は原則として違うヒトから採取した。また同時にmRNA測定用の凍結組織を採取した。
また、妊婦健診・分娩前後の際の定期採血（妊娠１０週前後に１回、妊娠２６週前後に１回、妊娠３６週前後に１回、入院時に１回、産褥３日目に１回、切迫早産入院中に適宜）の際に同時に採取し、白血球組織侵入アッセイに用いた。同時にmRNA測定、血清分析用の血液も計10 ml程度採取した。
現在は、白血球組織侵入アッセイを用いて妊娠経過中の末梢白血球活動性の曲線（leukocyte migration curve）を作成し、妊婦それぞれのmigration curveから、正期産・早産の両方において分娩に至るまでの遊走白血球数の増加指数、cut-off値を割り出すための解析を行っている最中である。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

平成28年度から29年度前半計画であった、血液検体収取および保存方法、血液検体からの白血球の精製とmRNAの抽出測定系が平成28年度でおおむね完了した。
また、検体収集が順調であるため、当初の予定を早めて白血球組織侵入アッセイを開始し妊娠経過中の末梢白血球活動性の曲線（leukocyte migration curve）を作成することができた。

Strategy for Future Research Activity

migration leukocyteの種別の違いの有無を正期産、早産分娩で検討するため、抗体を付加し、flow cytometryで解析を行う予定である。
さらに、Boyden chamberによる縦方向の白血球遊走だけでなく、TAXI-Scanを用いて水平方向の白血球遊走を観察し、分娩前後の白血球遊走能の違いをサンプルを追加し、検討していく予定である。

Causes of Carryover

物品費、旅費がともに予定額を下回ったため次年度使用額が生じた。サンプリングが予定より順調に行え、短期間で多くの検体を同時に処理できたことが試薬使用量が予定より少なくなった理由である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度は研究成果の報告のために、国際学会を含め複数の学会に参加する予定となっている。また、消耗品についても追加で補充が必要であるため、次年度使用額を活用して購入する予定である。