加齢による声帯粘膜固有層の線維化に対する新たな治療法の開発

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K20255
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 宮丸 悟 熊本大学, 医学部生命科学研究部, 助教 (10535636)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 声帯 / 加齢 / 線維化 / 抗線維化作用 / コラーゲン

Outline of Annual Research Achievements

加齢によって声帯の粘膜固有層に生じる線維化を、抗線維化作用を有する薬剤（ピルフェニドン）を使用することで回復させることができるかどうかを検討している。
これまで、生後8週齢（若年モデル）と生後18ヶ月齢（高齢モデル）のウイスター系ラットを用い、喉頭を摘出して声帯から組織を採取し、筋線維芽細胞の培養を行った。若年モデル12匹、高齢モデル24匹の組織を採取し培養した。培養細胞を用いてコラーゲンやヒアルロン酸、αSMAの免疫染色を行った。当初は細胞培養がなかなかうまくいかず、評価できている数は充分ではないが、加齢によってコラーゲンが増加し、ヒアルロン酸が低下する結果が得られている。これはこれまでに報告されているものと同様の結果であり、現在のモデルは本研究のモデルとして充分であると考えている。今後は数を増やして統計学的にその変化を検討したい。また、real time PCRやコラーゲンゲル収縮アッセイも行い、多角的に細胞外基質の変化を評価する。
平衡して、in vitro実験としてピルフェニドンを培養細胞に添加し、細胞外基質の変化について同様に免疫染色やreal time PCR、コラーゲンゲル収縮アッセイを用いて検討していく。
その後は、in vivo実験としてピルフェニドンを添加した飼料を高齢モデルに4週間投与し、ピルフェニドン投与の有無での声帯の組織像の変化を免疫染色を用いて比較検討する予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

地震による研究機材の故障によるの入れ替えや実験室の改修、変更による実験環境の変化などによってこれまでできていた実験がスムーズにできなくなり、実験結果にもそれが反映される結果となった。細胞培養でうまく細胞が増殖せず、当初の研究計画よりも実験がかなり遅れている状態である。ようやく培養細胞が安定して増殖するようになり、増殖した細胞は凍結保存している。
また、一部の細胞を用いて、コラーゲンやヒアルロン酸、αSMAの免疫染色を行い、手技の確立に努めた。
real time PCRやコラーゲンゲル収縮アッセイも行い、安定してきちんとした結果が得られるようになってきている。

Strategy for Future Research Activity

声帯内の筋線維芽細胞の培養が安定してできるようになってきており、今後は培養細胞を用いて免疫染色やreal time PCR、コラーゲンゲル収縮アッセイなどを行う予定である。年齢による違い、ピルフェニドン添加による変化を評価したい。
ただ、高齢モデルの入手に時間を要するため、評価できる数が揃うまでは一定の期間がかかる見込みである。

Causes of Carryover

実験動物の納入が遅れたことと、実験での細胞培養がうまくできず、その後の評価がかなり遅れているために次年度使用額が生じている。
次年度に当初の予定から遅れている実験を計画に基づいて進めていく予定である。具体的には摘出喉頭の細胞培養と培養した細胞の評価、薬剤を添加した飼料を用いた実験動物の飼育と評価を予定している。