鼓膜組織幹細胞の同定と動態の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K20287
• Research Institution: The Tazuke Kofukai
• Principal Investigator: 金井 理絵 公益財団法人田附興風会, 医学研究所 第5研究部, 研究員 (30574008)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: マウス鼓膜 / 組織幹細胞 / 免疫染色

Outline of Annual Research Achievements

鼓膜穿孔閉鎖治療では鼓膜再生の源となる細胞を誘導するために穿孔の辺縁を切除する、いわゆる、新鮮創化を行う。鼓膜再生の源になる組織幹細胞が鼓膜のどこかに存在する可能性があるが、その局在や穿孔閉鎖における動態は不明な点が多い。マウスを用いた動物実験によって鼓膜組織幹細胞の局在や穿孔閉鎖における動態を調べることが本研究の目的である。
初年度はマウスの鼓膜を側頭骨ごと採取する方法および鼓膜穿孔作成する手技を確立した。また、ＨＥ染色により、マウスの正常鼓膜はヒトと同様に上皮層、中間層、粘膜層の3層構造で構成されていることを確認した。
平成29年度はBrdU, Ki-67などによる染色で細胞分裂の盛んな領域を同定することを目標として、マウス鼓膜に対し免疫組織学的評価をこころみた。まずはマウス鼓膜における免疫染色の手順や条件を確立するため、正常の上皮層、中間層で発現すると予測されるサイトケラチンやビメンチンによる染色を施行したが、予測されたような抗体の発現がみられなかった。おそらく、凍結切片の乾燥や染色手技が毎回一定しなかったこと、抗体濃度の決定などに問題があった可能性があり、今後も検討を要する状態である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

マウス正常鼓膜および穿孔モデルに対してBrdU, Ki-67などによって細胞分裂の盛んな領域を同定する予定であったが、マウス鼓膜における免疫染色の手技の安定化や条件設定が予想よりも困難であったため、目標に到達できなかった。

Strategy for Future Research Activity

上皮層については上皮系、中間層については間葉系マーカーを用いてマウス鼓膜に対し免疫組織学的評価を行い、かつ、BrdU, Ki-67などによる染色で細胞分裂の盛んな領域を同定する。これを鼓膜輪、臍部、緊張部、弛緩部など部位ごとに評価し、鼓膜再生の源となる細胞の局在を同定する。また、鼓膜穿孔マウスを経時的にsacrificeし、上記項目を評価したうえで、穿孔閉鎖における細胞の動態を調べる。細胞分裂が盛んな部分を同定するために使用する抗体の種類についても検討が必要であるが、抗体の組み合わせを決定することが困難である可能性もあるので、上皮系や間葉系組織の発生にかかわるシグナルを発現するレポーターマウスを用いることも検討している。

Causes of Carryover

平成29年度の実験の進捗が予定より遅れており、マウス購入数や抗体などの試薬購入が少なかった。また、論文発表や学会発表を行うに至らなかった。これらの要因により翌年への繰越金が生じた。
免疫染色のための複数種類の抗体購入、マウスの追加購入、国際学会での成果発表、論文作成などに使用する予定である。