2016 Fiscal Year Research-status Report
角膜上皮細胞の特異性を規定している転写因子の機能解析と相互作用の解明
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16K20324
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
北澤 耕司 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (10760803)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 角膜上皮 / 転写因子 / ダイレクトリプログラミング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コア転写因子の機能解析を行うために、まず6つの転写因子のうちPAX6の解析を開始した。CRISPR/Cas9一体型プラスミドであるレンチウィルスベクターにPAX6をターゲットとしたsgRNAを作成しクローニングを行った。ヒト培養角膜上皮細胞に遺伝子導入してPAX6タンパクがノックアウトされたことをウェスタンブロッティングで確認した。ノックアウトをしても細胞形態は変わらず上皮性を維持していた。しかし、これらの細胞はmRNAレベルで、角膜上皮特異的遺伝子であるケラチン３、ケラチン１２、ALDH3A1、クラスタリンの発現が低下し、一方でケラチン１、ケラチン１０、インボルクリン、フィラグリンの発現が上昇した。またタンパクレベルにといても同様の発現変化を確認した。またマイクロアレイによる網羅的な解析を行うと、2倍以上の発現上昇した遺伝子は371遺伝子、発現低下した遺伝子は389遺伝子あり、発現上昇した遺伝子は有意にケラチノサイト関連遺伝子が多く含まれたいた。一方で、発現低下した遺伝子には有意に角膜関連遺伝子が含まれていた。この事は、PAX6が非角化粘膜上皮である角膜上皮細胞の性質と、角化上皮である皮膚細胞の性質を制御していることが示唆された。次にコア転写因子の１つであるOVOL2のノックダウン実験を行った。オフターゲット予防に4つのOVOL2ターゲットであるsiRNAを培養角膜上皮に導入し、機能解析を行った。細胞形態変化はノックダウン後に大きく変わり、細胞の上皮性が失われ、線維芽細胞様の形態に変化した。現在、OVOL2をノックダウン後の解析をさらに進めているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画通りにPAX6ノックアウト実験は終了しており、現在OVOL2をノックダウンして、遺伝子発現解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
予定通り進行しているので、今のままの計画通り進めていく。
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[Journal Article] OVOL2 maintains the transcriptional program of human corneal epithelium by suppressing epithelial-to-mesenchymal transition.2016
Author(s)
Kitazawa K, Hikichi T, Nakamura T, Mitsunaga K, Tanaka A, Nakamura M, Yamakawa T, Furukawa S, Takasaka M, Goshima N, Watanabe A, Okita K, Kawasaki S, Ueno M, Kinoshita S
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Journal Title
Cell Reports
Volume: 15
Pages: 1359-68
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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