2017 Fiscal Year Research-status Report
頭部外傷後脳神経細胞アポトーシスにおける小胞体カルシウムイオンチャネルの関与
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16K20393
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Research Institution | Yamaguchi University |
Principal Investigator |
戸谷 昌樹 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (00585721)
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Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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Keywords | 頭部外傷 / アポトーシス / ネクローシス / カルシウムチャネル / 小胞体 |
Outline of Annual Research Achievements |
頭部外傷後の脳神経細胞損傷には、直接損傷によって受傷直後から起こる早期細胞死(ネクローシス)と、受傷後の二次的損傷で起こる遅発性細胞死(アポトーシス)がある。この研究の目的は、小胞体カルシウムチャネル阻害薬を用いて、頭部外傷後の脳神経細胞アポトーシスに小胞体カルシウムイオンチャネルが関与しているか調べることである。頭部外傷モデルはLateral Fluid Percussion Injury (LFPI)モデルで、頭部外傷直後から7日目までで比較をして時間的影響と空間的損傷部位を検討した。 単染色においては、細胞死を調べるためにTdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL)染色と活性化カスパーゼ3染色を、神経細胞切断浮腫を調べるためにAmyloid Precursor Protein (APP)を用いた。昨年度のパイロットから対象を増やして非治療群における損傷細胞の時間的・空間的な変化をカウントした。アポトーシスは特に活性化カスパーゼ3染色において、頭部外傷後3日目まで増加しその後漸減した。アポトーシスの発現部位は、最も観察しやすいのは脳梁であった。損傷部位の周囲にもアポトーシスは認められたが、浮腫や組織の崩壊の影響が大きいように見受けられた。神経切断浮腫は、損傷部周辺にも認めたが、対側にも認めていた。 どの細胞がアポトーシスを起こしているのかを調べるために多重蛍光染色も行った。蛍光染色による活性化カスパーゼ染色で、単染色による活性化カスパーゼ染色部位と結果が同じになることを確認できた。脳梁においては、解剖学的に神経細胞体ではなくオリゴデンドログリアが原因になっていると考えられたため、Allophycocyanin (APC)とMyelin basic protein (MBP)を用いて染色をしている。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
この研究の目的は、頭部外傷後神経細胞アポトーシスにおける病態生理の解明と、アポトーシスにおける小胞体カルシウムチャネルの関与および治療戦略の検討である。1年目は、頭部外傷のモデル確立とパイロットスタディにおける染色の確認を単染色で行った。 2年目の目標は、パイロットスタディ結果を裏付けるために対象数を増やすことと、多重免疫染色による単染色の確認およびアポトーシス細胞の種類確認を開始することであった。当初予定していた治療群は、非治療群が確立してから行うこととしたため2年目には行わないこととした。単染色は、アポトーシスおよびネクローシスの指標として活性化カスパーゼ3染色とTUNEL染色を行った。頭部外傷および染色の手技が安定し、一定の結果が得られるようになった。脳神経細胞損傷を確認する方法として神経切断浮腫のマーカーであるAPP染色を追加した。アポトーシス細胞の確認は、海馬、脳梁および皮質下になるが、最も密度が多く確認できるのは脳梁であった。多重免疫染色においては、脳梁の損傷がオリゴデンドログリアであると予想している。当初Allophycocyanin (APC)を用いてバックグラウンドの染色をした。バックグラウンドの染色ムラが改善しないため、(Myelin basic protein) MBPに変更したが、染色がうまくいかないため現在手技を改良中である。蛍光染色における活性化カスパーゼ3染色では、単染色と同様に3日目が最も多く、その後は漸減することが確認できた。また、アポトーシスの原因として酸化ストレス傷害の影響を調べるために、malondialdehyde (MDA)やHigh Mobility Group Box 1 (HMGB-1)を染色する予定である。
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Strategy for Future Research Activity |
この研究における目標は、頭部外傷によるアポトーシス抑制が小胞体カルシウムチャネル阻害薬において可能か調べることである。平成29年度までの研究では、非治療群においてアポトーシスの好発部位や時間的影響を調べた。平成30年度以降の研究では、治療群においてアポトーシスの抑制が出来るかどうかを調べることが目標となる。小胞体カルシウムチャネルはリアノジン受容体(RyR)とイノシトール三リン酸受容体(IP3R)の2つが存在する。RyR阻害薬としてダントロレン、IP3R阻害薬にはXestspongin C (XeC)と2-Aminoethyl diphenylborinate (2-APB)を用いる。投与方法としては頭部外傷直前の脳室内投与を行う。単独投与と同時投与による単独チャネル阻害と複数チャネル阻害の影響も調べる。非治療群と治療群の比較はアポトーシスが最も増える3日目に行う。また、平成29年度に引き続き、多重蛍光染色でアポトーシスを起こした細胞種類の同定を行う。またアポトーシスの原因検索のために酸化ストレス傷害を中心に他の染色を追加する予定である。
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Causes of Carryover |
研究試薬等の価格の変動により残額が生じた。次年度の試薬等購入に用いる。
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