2018 Fiscal Year Research-status Report
頭部外傷後脳神経細胞アポトーシスにおける小胞体カルシウムイオンチャネルの関与
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16K20393
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Research Institution | Yamaguchi University |
Principal Investigator |
戸谷 昌樹 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (00585721)
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Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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Keywords | 頭部外傷 / アポトーシス / ネクローシス / カルシウムチャネル / 小胞体 |
Outline of Annual Research Achievements |
頭部外傷後におこる脳神経細胞損傷には、直接損傷によって受傷直後から起こる早期細胞死(ネクローシス)と、受傷後の二次的損傷で起こる遅発性細胞死(アポトーシス)があると考えられている。この研究では、小胞体カルシウムチャネル阻害薬によって頭部外傷後の脳神経細胞アポトーシスが抑制されるかを調べることが目的である。頭部外傷モデルはLateral Fluid Percussion Injury (LFPI)モデルを用いた。治療介入は、脳室内薬剤投与とした。 まずは、頭部外傷後のアポトーシスおよび神経細胞切断浮腫が時間変化によってどのように変化をするか検討した。受傷直後から7日目までの時間的影響と空間的損傷部位を調べた。摘出した脳標本を用いてTdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL)と活性化Caspase-3、そしてAmyloid Precursor Protein (APP)で染色をした。TUNEL染色においては損傷部分周囲の皮質下に少量認めた。受傷直後には少量であったが、受傷2日目、3日目に掛けて増加し、4日目から減少した。活性化Caspase-3染色は、脳梁で多く認め、視床を含む基底核にも出現していたが、皮質下にはほとんど認めなかった。損傷側だけでなく損傷部位対側にも認めた。受傷後1日目から3日目に掛けて増加し、4日目から減少をしていた。APP染色は脳梁に多く認めた。損傷部位側に多く、対側はまだらであった。受傷翌日に多く認め、その後徐々に減少した。この結果から、治療対照群との比較は受傷後3日目で比較することが最も効果的と分かった。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
この研究では、頭部外傷後神経細胞アポトーシスにおける病態生理の解明と、アポトーシスにおける小胞体カルシウムチャネルの関与および治療戦略を検討している。1年目は、頭部外傷のモデル確立とパイロットスタディにおける染色の確認を単染色で行った。2年目は、パイロットスタディ結果を裏付けるために対象数を増やすことと、多重免疫染色による単染色の確認およびアポトーシス細胞の種類確認を開始した。 3年目は、単染色における染色の分布と時間的変化をカウントした。単染色は、アポトーシスおよびネクローシスの指標として活性化Caspase-3染色とTUNEL染色、そして脳神経細胞損傷を確認する方法として神経切断浮腫のマーカーであるAPP染色を行った。TUNEL染色では予想をしたよりも細胞数は少なかった。活性化Caspase-3染色では3日目をピークに脳梁や基底核に多く染色細胞を認めた。APPは3日目にかけて脳梁に多く認めた。多重免疫染色は蛍光染色による活性化カスパーゼ染色で、単染色による活性化カスパーゼ染色部位と結果が同じになることを確認できている。バックグラウンドの染色ムラを改善できるか継続して行っている。
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Strategy for Future Research Activity |
この研究における目標は、頭部外傷によるアポトーシス抑制が小胞体カルシウムチャネル阻害薬において可能か調べることである。平成30年度までの研究では、非治療群においてアポトーシスの好発部位や時間的影響を調べた。平成31年度以降の研究では、治療群においてアポトーシスの抑制が出来るかどうかを調べることが目標となる。小胞体カルシウムチャネルはリアノジン受容体(RyR)とイノシトール三リン酸受容体(IP3R)の2つが存在する。RyR阻害薬としてダントロレン、IP3R阻害薬にはXestspongin C (XeC)と2-Aminoethyl diphenylborinate (2-APB)を用いる。投与方法としては頭部外傷直前の脳室内投与を行う。今後は、治療群の濃度決定及び治療効果を検討する予定である。濃度を変えて、適切な濃度を選定する。最も効果的であった濃度における単独投与と同時投与による単独チャネル阻害と複数チャネル阻害の影響も調べる。非治療群と治療群の比較はアポトーシスが最も増える3日目に行う予定である。アポトーシス細胞の同定のために、多重蛍光染色を行う予定である。
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Causes of Carryover |
研究試薬等の価格や、行った実験数が予定より少なかったことで残額が生じた。次年度の試薬等購入に用いる。
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