間葉系幹細胞の骨芽細胞系列への分化初期過程における細胞増殖・凝集機構の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K20414
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 松裏 恵子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 特別研究員 (20770423)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: Runx2 / MSC増殖 / MSC凝集 / 骨芽細胞

Outline of Annual Research Achievements

１）胎生18.5日のRunx2 koマウス、Sp7 koマウスの頭蓋冠よりRNAを抽出し、これらをRunx2 koマウスとSp7 koマウス間で、マイクロアレイ解析で比較した。２）胎生18.5日のSp7 koマウスの下顎骨領域および長管骨では、凝集した間葉系細胞は軟骨細胞に分化するため、胎生17.5日のRunx2 koマウス、Sp7 koマウスの大腿骨および脛骨から筋組織を除いた後、コラゲナーゼ処理し、間葉系細胞を採取、RNAを抽出した。また、Runx2 koマウスでは歯杯の発生が帽状期で停止しているが、Sp7 koマウスでは歯杯は正常に発生しているため、下顎骨領域では歯杯を含まない領域より間葉系細胞を採取し、RNAを抽出した。Runx2 koマウスとSp7 koマウス間で、マイクロアレイ解析で比較した。３）Runx2 koマウスに比較しSp7 koマウスで2倍以上発現増強され、バックグラウンドより10倍以上のシグナル強度を示した遺伝子を選択した。現在、頭蓋冠、下顎骨領域、大腿骨・脛骨のサンプルで共通して誘導された遺伝子は、リアルタイムRT-PCRで確認しており、今後、アノテーション情報、パスウェイ解析等によりクラス分けする予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の1年目の目標は7割は達成しており、来年度にも順序に続く研究成果となっている。

Strategy for Future Research Activity

現在に至るまでに、マイクロアレイ解析しているが、Runx2のsiRNAを頭蓋冠由来初代培養骨芽細胞に導入しており、今後、候補遺伝子の発現をリアルタイムRT-PCRで調べる目的で分析をおこなう予定である。
また、頭蓋冠由来初代培養骨芽細胞に発現ベクターを導入、MTTアッセイで細胞増殖を調べるとともに、細胞密度、骨芽細胞分化を調べる。骨芽細胞分化は、アルカリホスファターゼ染色およびvon Kossa染色を行うとともに、リアルタイムRT-PCRで骨芽細胞マーカー遺伝子(Runx2, Sp7, Col1a1, Spp1, Bglap)の発現を調べる予定である。

Causes of Carryover

選択された遺伝子のリアルタイムRT-PCR計測が翌年度実施となり、それに必要な費用が翌年度に繰り越しとなった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

リアルタイムRT-PCRで確認後、アノテーション情報、パスウェイ解析等によりクラス分けする予定である。