培養骨膜シートの新規骨再生経路の分子基盤の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K20534
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 上松 晃也 新潟大学, 医歯学総合病院, 医員 (80758889)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 歯槽骨再生 / 細胞治療

Outline of Annual Research Achievements

我々は骨膜細胞由来の培養人工骨：骨膜シートを用いた歯槽骨再生療法の研究を進めてきた。細胞移植による再生メカニズムとして、移植細胞が直接目的組織へと分化・成熟する直接的作用と移植細胞が放出する増殖因子・サイトカインが組織局所の治癒を補助・増強するという間接的作用が知られている。しかし、骨膜シートではその再生過程の厳密な検証がなされていない。本研究では後者の間接的作用に焦点を当て、骨膜シートの放出する増殖因子・サイトカインが局所に骨髄細胞を誘導し骨再生を促進させるという仮説を検証することを目的としている。
本年度は申請書に記載した種々の条件での培養を行い、細胞の性質の違いを検証した。また、現在追加で検証を行っている細胞搬送時の培養開始までの遅延がもたらす影響についても並行して検証した。汎用培地と幹細胞用培地の2種類の環境下での骨膜シートの増殖を比較をしたところ、以前行っていた研究とほぼ同様の結果であり、仮説通りの結果でもあった。また、細胞培養開始までの時間の遅延が与える影響についてはこれまで行ってきていなかったが、結果としては24時間程度の遅延であれば細胞の増殖や性質に大きな影響を与えるものでなく、培養開始後8週間後の時点で比較すると通常通りの培養とほとんど差異が無いことが確認された。
また、申請書に記載したキメラマウスを用いた移植実験も予備実験レベルで行い、キメリズム等の問題点はクリアできていることを確認した。移植後8週間では移植した骨膜シートは汎用培地、幹細胞用培地の違いに影響されず両方で石灰化の傾向が確認できた。しかし、石灰化の様子や量にはやや培地間での違いがあり、またGFP陽性のホスト側の骨髄細胞がこの現象にどれほど関与しているかはまだ詳細に検討できていない。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は申請時に計画した実験がおおむね順調に実施、進行できた。事前に予期されるトラブルとしてはヒトの骨膜細胞の検体が入手できない、マウスのGFP陽性の骨髄細胞移植がうまくいかず、予定したキメラマウスが作製できないなどの事象が想定されるも、これらをクリアして研究を進めることができている。

Strategy for Future Research Activity

今後はマウスへの骨膜シート移植実験を重ねて、移植後の細胞の動態を評価する段階へ入る。想定されることとしては仮説で示したように骨膜シートを移植した局所にGFP陽性細胞が集積しない、もしくは検出できないほど集積が微弱であるなどの問題がある。GFP陽性細胞の集積の有無をより詳細に検証するには、反応が弱い場合においてはより集積しやすいようにG-CSFを局所に注射することにより対応するなどの方策を現時点では考えている。
また、ヒト骨膜細胞の検体の不足は常に問題となりうるが、場合によっては凍結保存しストックしてある骨膜細胞を代替として使用することも視野に入れて進めることとする。

Causes of Carryover

現時点では動物実験に使用を計画している免疫染色用の抗体やそれに係る物品は購入していない。このため当初の所要額との差額が生じている。

Expenditure Plan for Carryover Budget

現時点で予備実験レベルでの動物実験で得られた標本ができている。翌年度は動物実験の実験系を確立を目的に免疫染色での条件検討を行う予定としている。この段階で上記の免疫染色に係る物品の購入に使用する計画である。