2016 Fiscal Year Research-status Report

脂肪幹細胞における細胞外カルシウムによる骨形成の検討

Research Project

Project/Area Number	16K20586
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	矢内理沙 (糸永理沙) 九州大学, 歯学研究院, 共同研究員 (60755271)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2018-03-31
Keywords	脂肪幹細胞 / 骨再生 / Ca / BMP-2
Outline of Annual Research Achievements	脂肪幹細胞より骨を形成するにあたり、まず Ca2+ 誘導性 BMP-2 産生の科学的証明を行うこととした。具体的には１）hASCs における細胞外 Ca2+ 刺激による細胞内 Ca2+ 濃度上昇のメカニズムを探る、２）細胞内 Ca2+上昇による BMP-2 産生までの細胞内シグナル伝達に関する因子を検索する、３）産生された BMP-2 と炎症メディエータ―との関係を探る、という研究計画を立てた。１）については、細胞外の Ca2+ 濃度を感知するシステムの候補としてCalcium sensing receptor (CaSR)、 TRP channel (特に TRPC channel)、G-protein coupled receptor 6A (GPCR6A)などを挙げ、定量的 real-time PCR、ウエスタンブロット法や各種選択的阻害剤を用いて Ca2+ イメージングや細胞培養を施行し同定した。その結果細胞外の Ca2+ 濃度の上昇により CaSR の発現増加が確認された。２）については、細胞外 Ca2+ 刺激による細胞内 Ca2+ 濃度上昇に誘導させる BMP-2 産生までの細胞内シグナル伝達には、NFAT 経路、PKCの関与が定量的 real-time PCR、ウエスタンブロット法により示唆された。また、Ca2+ 以外のイオンでは Mg2+ の相互作用も確認された。３）においては、培養中の培養液の各種炎症メディエータ―（プロスタグランジン、ロイコトリエン、インターロイキン、TNF-α等）を ELISA 等を用いて検索したが、骨形成に有効な炎症メディエータ―を明らかにできなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason H28年度の研究計画は in vitro における Ca2+ 誘導性 BMP-2 産生の科学的証明であった。脂肪幹細胞に細胞外 Ca2+ 刺激を加えると CaSR を介して細胞内 Ca2+ 濃度が上昇し、その結果自らBMP-2 産生することで骨形成能を高めることが示された。脂肪幹細胞に BMP-2 の刺激を加えることで骨形成を促す研究はこれまでにも報告されてきたが、大量に必要とされるリコンビナントBMP-2（rBMP-2）の製造コストが高価であることが臨床応用への課題であった。本研究で Ca2+ を作用させることで rBMP-2 を加えた場合と同程度の骨形成能を得られる可能性が示唆され、我々が目的とるす副作用の少ない安全で安価な治療への足掛かりが得られた。
Strategy for Future Research Activity	炎症メディエータ―がin vitroにおいてhASCsの骨形成に明らかな影響を及ぼさなかったため、今後は in vivo での検討を試みる予定である。また脂肪幹細胞を付着させた PGA をヌードマウスの皮下に移植し実際に骨が形成させるか確認する。PGA は数日の培養でその周囲に細胞が付着することが知られている。このため足場となる PGA を高濃度 Ca2+を含む骨分化誘導培地で脂肪幹細胞と共に培養後、ヌードマウスに移植する予定である。その結果ヌードマウスの皮下に移植し実際に骨が形成させるか確認し、また目的とする形態の骨を形成する方法を検索する。その後、顎裂を有したマウスの印象採得を行い、裂の形態を模型で再現し、裂部の形態に合った骨が形成されるか検討する。
Causes of Carryover	H28年度は in vitro のみであり、本研究も我々の過去の研究に沿ったものであったため新たに多くの試薬や抗体を購入する必要がなかった。また、H29年度の研究計画では in vivo を行うため、ヌードマウスの購入・飼育の維持、当大学アニマルセンターでの維持費等を考慮に入れると高額な費用が必要と考えられるため、次年度に費用を充てることとした。
Expenditure Plan for Carryover Budget	H29年度にも培養試薬と、細胞内シグナル伝達の特異的作動薬あるいは抑制剤を購入すること、実験動物購入及び飼育に関する費用として未使用額を充てることにしたい。また研究のまとめとして日本口腔外科学会で成果発表する予定で国内旅費を使用する。さらに、研究の集大成として、海外雑誌に投稿、アクセプトをめざし、残額分を論文校正料、投稿料、追加実験費として充てることにしたい。