Possible regulation of bone resorption in gingival cancer by NKG2D ligands

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K20612
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 岩崎 良恵 埼玉医科大学, 医学部, 助教 (30750880)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 歯肉癌上皮細胞 / MICA遺伝子 / RANKL

Outline of Annual Research Achievements

ヒト歯肉癌上皮細胞であるCa9-22細胞について、レトロウイルスを用いてMICAを過剰発現させることにしたが、成功しなかった。レトロウイルスはヒト細胞に感染しないということが判明した。そのため、早急に対応を考えた。解決にはしばらくかかったが、水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質VSV-Gを同時に遺伝子導入する方法があることが判明した。まず、レトロウイルスベクターのGFP遺伝子であるpMX-GFPをVSV-Gと一緒にScreenFectAを用いてplat E細胞へ遺伝子導入した。培養後２日目に培養上清を回収し、遠心して濃縮しポリブレンを加えたものをCa9-22細胞に添加した。培養３日目に蛍光顕微鏡にて観察したところ、GFPの蛍光を確認できた。本実験系の確立により、MICA遺伝子のCa9-22細胞への強制発現を検討した。レトロウイルスベクターのヒトMICA遺伝子については、vector builder社に作製を依頼した。ヒトMICA遺伝子pMMLV-hMICAをVSV-Gと一緒にScreenFectAを用いてplat E細胞へ遺伝子導入した。培養後２日目に培養上清を回収し、遠心して濃縮しポリブレンを加えたものをCa9-22細胞に添加した。培養３日目にRNAを回収してリアルタイムPCR法にてMICA遺伝子のmRNAを調べたところ、MICA遺伝子の発現がコントロールであるpMX-GFPと比較して有意に上昇していた。一過性にMICA遺伝子を過剰発現するCa9-22細胞が得られた。次にこのMICA遺伝子強制発現Ca9-22細胞においてRANKL発現を検討し、現在この解析を行っている。さらにMICA遺伝子強制発現Ca9-22細胞の培養上清をRAW264.7細胞に作用させ、RNAを抽出してRANKL等の遺伝子発現を調べている。また破骨細胞分化に対する作用も検討している。