2017 Fiscal Year Research-status Report
口腔癌臨床標本由来の変異NOTCH1の機能解析【新規標的治療開発に向けて】
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16K20614
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
青山 謙一 東海大学, 医学部, 助教 (10647530)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 口腔扁平上皮癌 / 大規模遺伝子解析 / NOTCH1変異 / NOTCH経路の腫瘍原性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①NOTCH経路の遺伝子および頭頸部扁平上皮癌で高頻度に変異が報告されている遺伝子（Stranskyら2011など）に加え、固形癌でドライバー変異がみられるとされる遺伝子を含めたパネルを作成して次世代シークエンサーにより行った。②WT、臨床検体由来変異NOTCH1（A465T）、MOCKの三種類のcDNAを用いてHEK293細胞にそれぞれ導入し、安定発現細胞（WT細胞、A465T細胞、MOCK細胞）を樹立した。これらを用いてNOTCH1の局在をFlow cytometry(FC)で、NOTCH1の活性をwestern blot (WB)、NICD（活性化NOTVH1)の局在を免疫蛍光法（IF)で評価し、NOTCH1の下流の因子（HES1、HEY1）発現をqPCRで評価した。腫瘍原性を細胞増殖能力とヌードマウスへの異種移植により評価した。
【結果】①P53などのがん関連遺伝子は他の固形癌と類似したスペクトラムで変異がみられた。NOTCH経路の遺伝子群に28%と高頻度に変異がみられた。NOTCH1変異についてはリガンド結合領域に集中していた。（口腔外科学会2017年、京都、発表）。②変異NOTCH1の細胞膜局在は不安定になっていた。WT細胞の活性化NOTCH1は核内に認められたが、変異NOTCH1においては細胞質に認められた。qPCRにおいてMOCKと比較し、WTではHES1、HEY1のmRNA発現量が有意に上昇していたが（3倍、P<0.01）、変異NOTCH1では有意に減少していた（37％、P<0.01）。細胞増殖能力はMOCK細胞と比較してWT細胞は有意に（p<0.01）細胞が上昇していたが、変異NOTCH1細胞においては有意に（p<0.01）低下していた。生着率はWT細胞は80%であったが、変異NOTCH1細胞では0%であった（Oncology Reports 2017）
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
臨床標本に対する遺伝子解析は終了しており、当初の目標を達成している。機能解析についても、NOTCHの腫瘍原性を考察するデータまでは得られている。そのため、おおむね順調と評価した。今後、臨床標本の遺伝子解析データを論文報告していきたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
臨床標本の遺伝子解析はに加え、機能面の評価としてトランスクリプトーム解析を予定している。
また、機能解析については、遺伝子改変マウスによる解析も行いたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
消耗品の価格改定により、若干の相違が生じたため。
次年度はサンプル数を追加することにより、差額を使用する。
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