IL-34二量体のCSF-1受容体を介した多様なシグナル伝達機構の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K20685
• Research Institution: Hyogo Medical University
• Principal Investigator: 川邊 睦記 兵庫医科大学, 医学部, 助教 (10760720)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: IL-34 / CSF-1 / 歯根膜細胞

Outline of Annual Research Achievements

新たに購入した歯根膜（PDL）細胞株を腫瘍壊死因子（Tumor necrosis factor-α；TNF-α）で刺激し，0，12，24，48時間後のPDL細胞からTRIzol Reagent（Life Technologies）にてRNAを抽出し，realtime PCR法にてIL34およびCSF1 mRNAsを評価した.その結果，TNF-α誘導性にPDL細胞は，IL34およびCSF1のmRNAs産生量が上昇した．CSF1のmRNAs産生に比較して，IL34のmRNAs産生は早期に開始した．
健常者より20ccの採血を行い，Ficoll-Paque（GE Healthcare Life Sciences）を使用し，PBMCsを分離した．さらに，得られたPBMCsからHuman Monocyte Enrichment Kit（StemCell Technologies）を用いて，単球／マクロファージ系細胞を分離した．分離した単球／マクロファージ系細胞を96穴プレートに播種した．soluble RANKL (20 ng/mL, Bioindustry Division)存在下で一定期間，RPMI1640培地にて，経時的にrecombinant CSF-1とIL-34二量体で培養した．破骨細胞への分化および成熟はtartrate-resistant acid phosphatase（TRAP） 酵素活性を指標にする染色法で評価した．その結果，recombinant CSF-1と比較し，recombinant IL-34は単球／マクロファージ系細胞への細胞維持能が高かった．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

大学病院における診療業務が多く，研究に対するエフォートが減り，研究の進行がやや遅れている．今後，当初の予定研究成果を遂行できるよう努力する．

Strategy for Future Research Activity

今後，TNF-αで刺激したPDL細胞を4日後に回収し，免疫染色法およびWestern blotting法にてIL-34およびCSF-1蛋白質を観察する．さらに産生蛋白質量を定量するために，TNF-αで刺激したPDL細胞の培養上清を4日後に回収し，ELISA法にてIL-34またはCSF-1蛋白質を定量した．同時に，TNF-α刺激によりPDL細胞株が発現する破骨細胞分化への貢献が予測されているMMP3をポジティブコントロールとして定量する．PDL細胞の培養上清刺激後の各時間帯の単球／マクロファージ系細胞由来分化・成熟細胞より蛋白質を回収する．WB法およびELISA法にて，アポトーシス関連分子カスパーゼの蛋白質量を定量する．カスパーゼの経時的変化から，分化・成熟機構と（ミトコンドリア系カスパーゼ9→3→6→7），（細胞膜表面受容体系カスパーゼ8→10→2→3→6→7），（小胞体系カスパーゼ12→3→6→7）および（ストレス系カスパーゼ3→6→7）の関与を証明する．この結果から，CSF-1と比較したIL-34の破骨細胞前駆細胞維持能を考察する．

Causes of Carryover

大学病院における診療業務が多く，研究に対するエフォートが減り，研究の進行がやや遅れている．

Expenditure Plan for Carryover Budget

今後，当初の予定研究成果を遂行できるよう努力し，予定通りの使用額を使用する．