高齢者の健康寿命延伸をめざす第一次・二次予防での歯槽骨再生法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K20703
• Research Institution: The Nippon Dental University
• Principal Investigator: 伊井 久貴 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (00746604)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 歯学 / 細胞・組織 / 再生医学 / 衛生 / 骨再生

Outline of Annual Research Achievements

高齢化社会が進む我が国において、口腔顎機能低下や歯牙喪失から国民を守り、健康寿命の延伸を図ることは喫緊の課題である。その中で、５５-６４歳における有病率が８０％を超える歯周疾患、なかでも歯槽骨欠損からの回復が可能となれば、高齢者のQOL向上のみならず、国民医療の大幅な改善が見込める。
本年度は、ヒト歯肉線維芽細胞（HGF)からの石灰化誘導法の確立を目指して行った。HGFを播種し、２４時間後にウェル表面を覆うように培養液を追加し、中心部がコンフルエントになるまで２－３日培養する。その後、アスコルビン酸とβ-グリセロフォスフェイトを添加した培養液に切り替え、２日ごとに培養液を換えながら、３－４週間培養する。この手法の特徴は、培養皿の中心部に高濃度に細胞を播くことで、早期に高密度な培養状態を作り出し、骨系の細胞への分化の促進をはかろうとするものである。
石灰化の評価は、まず４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、洗浄後、骨芽細胞のマーカーであるALP染色を行い、その後、析出した石灰化物の評価としてフォンコッサ染色を行う。
現在、HGFでは安定的に石灰化が起きないため、細胞をヒト歯髄幹細胞やHGFから間葉系幹細胞マーカーであるCD90やCD45で選択された細胞で再実験を行っている。
これは難しい歯槽骨再生に道を拓く。本研究では、この石灰化現象を生じる歯肉線維芽細胞集団の機能を解明し、これをエピタキシーとし、新たな侵襲がほとんど無い歯槽骨再生法を開発し、高齢者の健康寿命の延伸を図ることを目的とする。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

現在、ヒト歯肉線維芽細胞（HGF）を異所性石灰化の誘導を図るため、Micromass culture法により２４結のマルチウェルプレート上に５x１０４cells/１５０uMのドロップになるように播き、２４時間後にウェル表面を覆うように培養液を追加し、中心部がコンフルエントになるまで２－３日培養。その後、アスコルビン酸とβ-グリセロフォスフェイトを添加した培養液に切り替え、２日ごとに培養液を換えながら、３－４週間培養しているが、染色後の石灰化度の差が大きく出ており。結果が安定してこない。
理由としては採取した組織の個体差が考えられる。分離した細胞には未成熟なものが含まれており、石灰化が起きるときはそれらから骨系の細胞へ分化しているものと考えられる。

Strategy for Future Research Activity

より未成熟な細胞が多い集団の方が結果の安定が見込めるので、細胞の系統の変更に取り組んでいる。
具体的には、細胞をヒト歯髄幹細胞やHGFから間葉系幹細胞マーカーであるCD90やCD45で選択された細胞を使い、再実験を行う。
石灰化誘導法の確立後は、TNAP（組織非特異的ALP）、RUNX2、SPP1（オステオポンチン, OPN）、MGP（マトリックスGlaプロテイン）、ANK、ENPP1、などの異所性石灰化遺伝子やCD29・CD105・CD90、Sox2、Oct3/4、SSEA-4などの多能性マーカーなどのプライマーを用い、Real-time PCRで解析を行う。異所性石灰化のメカニズムは促進作用や抑制作用が複雑に連動する場合が多く、遺伝子解析を行う意義は大きい。遺伝子解析後は、同様に３－４週間の培養後の細胞を用い、ウエスタンブロット法や免疫染色法を使って、TNAP（組織非特異的アルカリフォスファターゼ, ALP）、RUNX2、SPP1（オステオポンチン, OPN）などの異所性石灰化やOct3/4やSSEA-4などの多能性マーカーのタンパク質の発現を観察・分析する。

Causes of Carryover

現在、培養実験における個体間の石灰化度の差が大きく、歯肉線維芽細胞で安定的に石灰化現象が起きない。理由としては採取した組織の個体差が考えられる。分離した細胞には未成熟なものが含まれており、石灰化が起きるときはそれらから骨系の細胞へ分化しているものと考えられる。
その為、当初計画していたタンパク発現や遺伝子発現への実験系が行えていないため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

本研究は3年度を通じて、歯肉線維芽細胞の分離と細胞を用いた様々な実験が主体となるため、研究経費の多くはヒト歯肉線維芽細胞の分離・増殖のための培地、TNAP（組織非特異的アルカリフォスファターゼ, ALP）、RUNX2、SPP1（オステオポンチン, OPN）、MGP（マトリックスGlaプロテイン）、ANK、ENPP1などの異所性石灰化遺伝子やCD29・CD105・CD90、Sox2、Oct3/4、SSEA-4などの多能性マーカーなどの各遺伝子プライマー、TNAP（組織非特異的アルカリフォスファターゼ, ALP）、RUNX2、SPP1（オステオポンチン, OPN）などの異所性石灰化やOct3/4やSSEA-4などの多能性マーカーやそれに伴うシグナル伝達系解析のための抗体などの消耗品に当てる。