2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K20875
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
渡邊 崇之 北海道大学, 電子科学研究所, 研究所研究員 (70547851)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 性決定 / 性的二型神経回路 / doublesex / fruitless |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、まず Dsx 発現細胞の同定を行うために必要な、コオロギ Dsx に対する特異的抗体の作成を行なった。 コオロギ脳内で発現する Dsx には３種類のアイソフォームが存在する。これまでに行った mRNA レベルの発現解析により、これらの３種類の Dsx アイソフォームは、オスで発現量の多い Male-type Dsx (DsxM), メス特異的な Female-type Dsx (DsxF’)、そして両方の性で同程度に発現する Common-type Dsx (Dsxcom) に分かれる。これら Dsx アイソフォームは、C-末端にアイソフォーム特異的な領域を持つ。抗コオロギ Dsx 抗体の作成にあたり、大腸菌発現系を利用してアイソフォームの共通領域ならびに DsxM、Dsxcom のアイソフォーム特異的領域を GST 融合タンパクとして大量発現・精製し、抗原として用いた。DsxF’ についてはアイソフォーム特異的配列が短いため、この領域に相当するペプチドを人工合成し、抗原とした。抗コオロギ Dsxcom 抗体以外についてはすでに抗血清を得ており、現在抗体の性能評価を進めている。
上記の実験と並行して、CRISPR/Cas9 system を利用した Dsx knockout 系統の作成の準備も進めた。本研究ではコオロギ脳内で Dsx を発現する神経細胞の細胞形態を可視化するために、Dsx 遺伝座に GFP 遺伝子を挿入する CRISPR/Cas9-based Gene Trap system を構築する。そのために必要な、Dsx 遺伝子構造の解析や Gene Trap vector の構築を進め、来年度初頭に CRISPR/Cas9-based Gene Trap system に関わる遺伝子導入実験を遂行するための準備を整えた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
原始的な不完全変態昆虫における脳・神経系の性分化の分子基盤・神経基盤とその進化を探るべく、本研究ではこれまでにモデル昆虫であるショウジョウバエ脳で脳の性分化に関与する fruitless 遺伝子、doublesex 遺伝子に着目し、昆虫におけるこれら２遺伝子のの分子進化を明らかにして来た。今年度はコオロギ脳で性分化を担うと予想される doublesex 遺伝子について、この遺伝子を発現する神経細胞の可視化・同定を進めるために必要な実験ツールの確立を進めることができた。本年度はほぼ想定通りに研究が進捗しており、これまでの研究状況・準備状況を踏まえ、次年度に本研究の目的を達成することは十分に可能だと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度である次年度は、doublesex 遺伝子が脳の性差を決定するかどうか、また脳の性差が発生段階のどのステージで生み出されるのかを神経回路レベルで明らかにする。このためには doublesex 遺伝子の機能阻害実験や doublesex 遺伝子を発現する神経細胞の細胞形態の可視化が必要となる。そのために次年度は、CRISPR/Cas9 システムを利用した Gene Trap システムの構築と、Gene Trap システムを利用した doublesex 遺伝座への GFP 遺伝子の挿入実験を遂行する。
これまで申請者はトランスポゾンを利用した遺伝子導入法を利用して来たが、この方法には対象とする遺伝子のプロモーター領域の同定や、遺伝子導入系統の樹立に必要な掛け合わせ・スクリーニング実験に多大な労力・時間が掛かるというデメリットがあった。一方 Gene Trap システムを利用した場合、①３ヶ月で系統樹立ができることや、②遺伝子破壊系統を得ることができること、など、本研究の研究目的を達成するために必要な研究手法である。
次年度は GeneTrap 法を利用した GFP knockin 系統の樹立を進め、コオロギ脳内 doublesex 発現細胞の可視化を行う。さらに GFP knock-in 系統の掛け合わせによって得られる doublesex null 突然変異体系統の表現系を調査することで、本研究の目的を達成する。
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| Causes of Carryover |
本年度、抗体作成に必要な抗原タンパク質の合成・精製に一部遅れが生じたため、抗体作成作業を一部翌年度に延期した。そのため、次年度使用額が生じた。この差額は、当初の目的である抗体作成に使用する。
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