ブタの精漿タンパクが子宮に及ぼす免疫変化の機序の解明と受胎性の関係に関する研究

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K20884
• Research Institution: Oita University
• Principal Investigator: 奥山 みなみ 大分大学, 医学部, 助教 (50756781)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 豚 / 受胎 / 精漿 / 免疫 / 子宮内膜

Outline of Annual Research Achievements

本申請研究は精漿を利用したブタの繁殖成績の向上を目指し、精漿に含まれるタンパク質の機能と子宮内膜上皮の免疫反応に焦点をあて、精漿がブタの受胎性におよぼす影響を明らかにすることを目的としている。
研究初年度に立ち上げた豚の子宮内膜上皮細胞の単独培養系を安定的に実施できるようになったため、in vitroにおいて子宮内膜細胞に精漿を添加し、暴露後の各種増殖因子の発現変化を定量している。これまでに複数の増殖因子について発現量の変化が認められた。
また、研究初年度に難航していた精漿の濾過についは、いくつかのfiltrationおよび遠心条件を組み合わせることで可溶化タンパクの化学的性質に影響をあたえることなく、コンタミネーションを可能な限り排除することに成功している。
さらに、本年度は豚の末梢血単核細胞（PBMC）の分離に取り組むとともに培養系の立ち上げと精漿添加予備試験を実施した。本項目は、研究の申請時には未計画であり新たに実験に加えた内容である。子宮内膜細胞の培養系において子宮局所の精漿への反応を解析するのと同時に、全身性の免疫反応を合わせて評価するため、豚PBMCの分離培養と培養液に精漿を添加した場合の反応を評価することを目的としており、これまでにPBMCにおいて発現している複数のサイトカイン発現量が精漿添加後短時間で変化することを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究初年度に立ち上げた培養系を安定的に維持することができている。研究の内容上、細胞を継代維持することができず実験毎にプライマリーカルチャーを実施するため、時間がかかる実験ではあるが、より生体の現状に近い結果を得ていると考えている。

Strategy for Future Research Activity

以下の通り研究を進めていく。
［実験１：子宮内膜の培養細胞への精漿添加試験］生体から採取し培養した子宮内膜上皮細胞について、精漿を添加培養することで、子宮における精漿への初期反応を明らかにする。その際には、加える精漿の化学的・物理的条件を比較するため精漿全液、非働化したもの、あるいは透析したものなどをそれぞれ条件検討として加える。解析にはリアルタイムPCR、ELISA、フローサイトメトリー等を利用するため、まだ確立されていない実験系については条件検討を行う。
［実験２：末梢血単核細胞（PBMC）の分離培養と精漿添加試験］本研究の申請時には未計画であり新たに実験に加えた内容である。本年度に、予備検討として分離した豚PBMCに精漿を添加して細胞の生存率を確認しているが、長時間の生存率が低く短期的な実験しか行えていない。以降は添加する精漿の条件を実験１同様に複数検討し、精漿成分がPBMCに与える影響を精査していく。

Causes of Carryover

【次年度使用額が生じた理由】細胞分離および培養実験を安定的に行えるようになったため、それに必要な経費が抑えられたと共に、培養実験にかける時間を多く割いたため、解析等のよりコストのかかる実験を次年度に実施する予定としたため。
【次年度使用額の使用計画】本年度進めてきた培養実験の解析を行う。また、新たな手法を実験に取り入れるため、豚の子宮内膜細胞の共培養系など習得のための研修費にも使用予定である。研究計画最終年度でもあるため、学会発表あるいは論文発表のために必要な経費としても使用する。