2016 Fiscal Year Research-status Report
RNA編集酵素ADAR1が関与するゲノム安定化機構の解明
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16K20895
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
有吉 健太郎 弘前大学, 被ばく医療総合研究所, 助教 (50462750)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ADAR1 / DNA二重鎖切断 / ゲノム不安定性 / DNA損傷修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ADAR1タンパク質がDNA二重鎖切断部位の修復に関与しているかを検証するため、正常ヒト細胞HDFnにsiControl処理した対照細胞、及びsiADAR1によってADAR1をノックダウンしたsiADAR1処理細胞に2GyのX線を照射したのち、DNA二重鎖切断損傷の継時的な定量化を行なった。蛍光免疫染色によりDNA二重鎖切断損傷マーカーであるγH2AX及び53BP1フォーカスを検出し、各フォーカスの数的変化を比較したところ、siControl処理した対照細胞と比較して、siADAR1処理細胞においては、時間とともにフォーカス数が減少せず、対照細胞よりも有意に高い頻度でみられた。また、siCont処理細胞、及びsiADAR1処理細胞の両細胞に1Gy～4GyのX線を照射し、コロニー形成法により放射線感受性試験を行ったところ、siADAR1処理細胞では対照細胞と比べて高い放射線感受性を示した。次に、ADAR1タンパク質のDNA二重鎖切断部位への集積性を調べるため、タモキシフェン誘導体4-OHTを処理することによってDNA二重鎖切断を誘導することが可能なHT1080-Ippo1を使用し、γH2AX及び53BP1フォーカスとADAR1の局在を調べた。4-OHTを処理した際、γH2AX及び53BP1フォーカスが出現し、かつそれぞれのフォーカスにADAR1も共局在することが判明した。さらに、クロマチン免疫沈降法を用いて、ADAR1のDNA切断部位への集積性を検討した。4-OHT処理したHT1080-Ippo1と未処理の細胞をADAR1抗体を用いて免疫沈降し、IPPo1カッティングサイトのプライマーを用いてPCRを行なったところ、4-OHT処理細胞ではクリアなバンドがみられた。これらの結果から、ADAR1タンパク質はDNA二重鎖切断部位に集積していると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
該年度における当初の研究計画事項がおおむね遂行されているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成24年度も引き続き、前年度の研究進捗状況を踏まえて当初の研究実施計画を実施する予定である。
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