特定の細胞周期で機能するCas9による多重遺伝子ノックインマウス作製

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K20929
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 水野 沙織 (飯島沙織) 筑波大学, 医学医療系, 研究員 (80732106)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: CRISPR/Cas9 / ノックイン / 細胞周期

Outline of Annual Research Achievements

目的遺伝子座に外来遺伝子が導入されたノックインマウスは、生体で生じる複雑な生命現象を理解するために、様々な研究分野で広く使われている。特に、多重遺伝子ノックインマウスは、分子間・細胞間の相互作用の解析やより高次元のヒト化マウス作製などが可能となるため、高い需要がある。本研究は、CRISPR/Cas9システムを用いて、より効率的な多重遺伝子ノックインマウス作製方法の確立を目指したものである。
平成２８年度は、細胞周期とノックイン変異が生じる時のDNA修復経路の関係性に着目し、特定の細胞周期のみで機能する新規Cas9タンパク質を構築した。遺伝子改変マウスの作製方法には、マウスES細胞を用いる場合とマウス受精卵を用いる場合とがある。そこで、この新規Cas9タンパク質のノックイン効率への有効性を調べるため、単一遺伝子ノックイン系を構築し、マウスES細胞およびマウス受精卵に導入した。マウスES細胞に導入した場合には、予想に反して、ノックイン効率に違いは見られなかった。これは、遺伝子導入時にマウスES細胞の細胞周期が同調していなかったのが、原因と考えられる。一方、マウス受精卵に導入した場合には、ノックインマウス作出効率が大幅に上昇するという非常に良好な結果が得られた。複数の遺伝子座に対して、新規Cas9タンパク質の効果を調べたが、マウス受精卵ではどの実験系においても、ノックイン効率の上昇が確認できた。さらに、マウス受精卵で生じさせたノックイン変異は個体作出後も維持され、次世代へと伝播可能であった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通り、新規Cas9タンパク質の構築が終了し、単一遺伝子ノックイン系では、マウス受精卵でのノックイン効率が上昇することを確認できたため。

Strategy for Future Research Activity

単一遺伝子ノックイン系で、新規Cas9タンパク質の効果が確認できたマウス受精卵に関しては、当初の予定通り、複数遺伝子ノックインマウスの作製を試みる予定である。
一方、単一遺伝子ノックイン系で、その効果が確認できなかったマウスES細胞に関しては、細胞周期を同調させた状態で再挑戦し、その効果を調べる予定である。