2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a novel bioluminescent probe and visualization measurement of biomolecules
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16K21060
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| Research Institution | Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University |
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Principal Investigator |
福永 圭佑 沖縄科学技術大学院大学, 核酸化学・工学ユニット, 研究員 (80639279)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 非天然アミノ酸 / 無細胞タンパク質合成系 / 人工タンパク質 / ルシフェラーゼ / 抗体 / クリック反応 / 発光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、当研究のベースとなっているN末端選択的化学修飾法を用いたIgG型蛍光プローブの作製法に関して英国王立化学協会・速報誌に論文発表を行った（代表者ら、Chem. Commun. 54, 12734, 2018）。
大腸菌無細胞タンパク質合成系を用いたアルキン導入ルシフェラーゼの発現を試みた。まず、プロパルギル基を直交性官能基として有するBoc保護非天然アミノ酸に対してクロロアセトニトリルを反応させ、カルボキシル基の活性化を行った。さらに、ジヌクレオチドpdCpAと反応させ、脱Boc化反応によりアミノアシル化pcCpAを合成した。別に調製した古細菌由来tRNA(CUA)断片3種類とアミノアシル化pdCpAを酵素化学的にライゲーションすることにより、アミノアシル化tRNAの作製を行った。GFPuv5を発現レポーターとしてアンバーサプレッサー法により、無細胞タンパク質合成系における非天然アミノ酸の導入効率を検討した。いずれの古細菌由来tRNAを用いてもプロパルギル-リシンをタンパク質に導入することが出来ることが分かったが、導入効率には2倍程度の差違があった。次に、Gaussia由来ルシフェラーゼのN末端、あるいはC末端にそれぞれプロパルギル-リシンを導入することを試み、ウェスタンブロット解析及び発光測定により発現を確認した。予め調製しておいた"糖鎖アジド基導入・N末端蛍光標識IgG抗体"に対してクリック反応によるルシフェラーゼ標識を試み、発光測定を行ったがルシフェラーゼ由来の発光を観察することはできなかった。SDS-PAGEによる分子量サイズの確認を行った結果、重鎖の分子量が変化しておらず、クリック反応が機能していないことが判明した。His-tagが配位子(THPTA)と競合するという報告があり、別の精製用タグを使った系を検討したい。
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Research Products
(1 results)
