2017 Fiscal Year Research-status Report
フシコクシン誘導体の細胞内標的同定：低自由度リンカーによるアフィニティ精製
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16K21138
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
樋口 雄介 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (10723439)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | フシコクシン / ケミカルバイオロジー / アフィニティー精製 / タンパク質間相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、ISIR-005担持磁気ビーズを用いて細胞破砕液からの14-3-3・リン酸化タンパク質複合体のプルダウン実験の検討を行った。昨年度に行った予備的な検討では、プルダウンサンプル中にコントロールに比べ有意に濃い標的候補タンパク質のバンドが複数検出された。精製タンパク質を用いたin vitroでの試験において、ほぼ同等の14-3-3・リン酸化タンパク質複合体補足能を有した3種のリンカーを比べた結果、剛直な構造を有するジインリンカーを有する磁気ビーズが最も非特異的吸着が少なかった。
しかし、MS/MSイオンサーチ、及びウェスタンブロットによって14-3-3タンパク質の検出を行ったが、全てのサンプル中に14-3-3タンパク質は確認されなかった。同条件で、再現性の確認を行ったが、ISIR-005担持磁気ビーズ特異的に結合するタンパク質には再現性があり、これらの多くはミトコンドリア関連膜タンパク質であった。これらは、14-3-3の関わらない活性標的タンパク質、または、ISIR-005の疎水性の高さに起因する擬陽性バンドである可能性があると考えたれた。
これとは別に、研究の過程で、ISIR-005よりも極性が高く、天然フシコクシン（FC）の10倍以上の14-3-3結合親和性を有する高活性FC誘導体を見出した。そこで、磁気ビーズに担持するFC誘導体を従来のISIR-005から、14-3-3への結合力が高く、高極性で非特異的なタンパク吸着が起こりにくいと考えられる、高活性FC誘導体へと変更することとした。
磁気ビーズへ担持する分子の変更に伴い、リンカーを導入したプローブ分子の合成を行った。まずは最も合成の容易なPEGリンカーを有する化合物の合成を完了した。これを、様々な濃度で磁気ビーズに担持し、精製タンパク質を用いて最適な担持濃度を決定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究過程で、高活性FC誘導体を見出したことで、ISIR-005担時ビーズでアフィニティー精製実験を続けるか、プローブを高活性FC誘導体に変更するかの選択を迫られたが、14-3-3への結合力が高さと、ISIR-005で問題となっていた疎水性の問題を回避できる可能性から、プローブの変更を行った。これにより、プローブ分子の合成から実験をやり直す必要が生じたため、実験が遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずは、合成の完了したPEGリンカーを有する高活性FC誘導体担持ビーズを用いて、アフィニティー精製実験を行う。まずは、この高活性誘導体を種々の培養細胞での評価を行い、これまで得られているFC誘導体の生物活性の中で、どの活性を標的としてアフィニティー精製実験を行うかを決定する。標的とする細胞が決定できたら、実際にアフィニティー精製実験を行い、まずはウェスタンブロットでプルダウンサンプル中に14-3-3タンパク質が存在するかを確認する。その存在が確認できれば、銀染色から、リン酸化タンパク質の候補を絞り、タンパク質の同定を行う。通常の条件では、14-3-3をプルダウン出来ない場合は、フシコクシンが標的のリン酸化レベルを変化させている可能性を考え、細胞培養中に予めFCを加えておき、リン酸化を誘導する等のサンプルの調整方法を検討する。
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| Causes of Carryover |
プローブ分子の再設計、合成に伴って、当初の研究計画に遅れが生じ、研究期間の延長を行ったため。
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