Identification of intracellular targets of fusiccocin derivatives ; infinity purification via rigid linker

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K21138
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 樋口 雄介 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (10723439)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: フシコクシン / ケミカルバイオロジー / アフィニティー精製 / タンパク質間相互作用

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、多数のリン酸化タンパク質と相互作用する14－3－3タンパク質のタンパク質間相互作用（PPI）安定化剤として機能するフシコクシン誘導体の細胞内標的を14－3－3/リン酸化タンパク質/フシコクシンの三者会合体として細胞破砕液から単離することを目的とする。前年度までに、天然フシコクシンの10倍以上のPPI安定可能を有する高活性FC誘導体を見出し、これを共有結合的にビーズに固定した高活性FC誘導体担持ビーズを作成した。本年度はまずアフィニティ精製実験の条件検討を行った。精製タンパク質を使ったモデル実験では、界面活性剤濃度が0.1％のときに最も効率よく三者会合体をプルダウンできることが分かった。一方で、細胞破砕液を調整する際には1％の界面活性剤を使用する。まずは、調整した細胞破砕液を10倍希釈し、最適な界面活性剤濃度に調整してプルダウン実験を行った。しかしながら、細胞破砕液の回収条件を変更しながら何度かプルダウンを試みたものの、いずれの条件においても回収したサンプル中に14-3-3タンパク質が確認されなかった。そこで、標的となるリン酸化タンパク質と14-3-3タンパク質の濃度の低下が標的を回収できない要因であると考え、界面活性剤濃度１％の細胞破砕液を希釈せずにそのままプルダウン実験に用いたところ、回収したサンプル中に14-3-3タンパク質が存在することがウェスタンブロット法によって確認できた。ビーズに結合していないフシコクシン誘導体を競合させることで14-3-3タンパク質が減少することから、非特異的な吸着ではなく、三者会合体を単離出来た可能性が高いことも確かめられた。今後、未同定のリン酸化タンパク質の確認を行う予定である。

Research Products

• [Int'l Joint Research] the City Of Hope(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: the City Of Hope
• [Int'l Joint Research] McGill University(カナダ)
  • Country Name: CANADA
  • Counterpart Institution: McGill University
• [Int'l Joint Research] Eindhoven University of Technology(オランダ)
  • Country Name: NETHERLANDS
  • Counterpart Institution: Eindhoven University of Technology
• [Journal Article] Cooperativity basis for small-molecule stabilization of protein protein interactions (2019)
  • Author(s): de Vink, P; Andrei, S; Higuchi, Y; Ottmann, C; Milroy , L-G; Brunsveld, L
  • Journal Title: Chemical Science Volume: 10 Pages: 2869-2874
  • DOI: 10.1039/C8SC05242E
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structural Effects of Fusicoccin upon Upregulation of 14‐3‐3‐Phospholigand Interaction and Cytotoxic Activity (2018)
  • Author(s): Ohkanda, J; Kusumoto, A; Punzalan, L; Masuda, R; Wang, C; Parvatkar, P; Akase, D; Aida, M; Uesugi, M; Higuchi, Y; Kato, N.
  • Journal Title: Chemistry A European Journal Volume: 24 Pages: 16066-16071
  • DOI: 10.1002/chem.201804428.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rationally Designed Semisynthetic Natural Product Analogues for Stabilization of 14‐3‐3 Protein Protein Interactions (2018)
  • Author(s): Andrei, S; de Vink, P; Sijbesma, E; Han, L; Brunsveld, L; Kato, N; Ottmann, C; Higuchi, Y;
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition Volume: 57 Pages: 13470-13474
  • DOI: 10.1002/anie.201806584.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research