2016 Fiscal Year Research-status Report
細胞内in situ誘導体化による細胞内分子局在解析
| Project/Area Number |
16K21276
|
|---|
| Research Institution | University of Shizuoka |
|---|
Principal Investigator |
水野 初 静岡県立大学, 薬学部, 助教 (30457288)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | メタボロミクス / オルガネラ / 誘導体化 / 質量分析 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本年度の研究では、細胞内に存在するオルガネラなどの微小部位に存在する代謝物を選択的に分析するために、細胞内やオルガネラ内で代謝物を誘導体化させるための誘導体化試薬の開発と、誘導体化した代謝物の分析方法の開発を行った。
細胞内のオルガネラなどの微小部位に存在する低分子代謝物を選択的に検出するために、細胞内部に導入し、目的とするオルガネラ以外での誘導体化反応の進行を防ぐため、誘導体化反応のon/offをコントロールすることができる光反応を誘導体化に用いることとした。光反応基については、UVにより反応が進行し、比較的反応収率が良いとされるジアジリンを用いることとし、アミノ酸などのモデル代謝物を用いて反応条件の検討を行った。さらに細胞内代謝物と光反応した誘導体化生成物を選択的に検出するためのLC-MS分析条件の検討を行った。
また、質量分析を行う際の大きな問題としてエレクトロスプレーイオン化の際に、夾雑物質によるマトリックス効果によりサンプル間のデータのばらつきが挙げられる。このようなサンプルごとのイオン化のばらつきを一斉に補正するため、安定同位体標識化したクロレラ抽出液を内部標準物質として用い、クロレラ中の安定同位体標識化された代謝物のイオンピークを利用して検出された代謝物を一斉に補正するための方法の開発を行った。その他、代謝物やペプチドのキラル異性化体を分離・検出するための新規方法についても開発し、LC-MSによる代謝物分析の基盤技術の開発を行った。これらの質量分析による代謝物検出における基礎的研究開発に関して論文発表及び学会発表を行った。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題遂行の要となる、細胞内オルガネラなどの標的微小領域に取り込まれ、その中に存在する代謝物と反応することができる、新規誘導体化プローブの開発を行った。誘導体化反応は、細胞内の不特定多数の場所で誘導体化反応を起こさずに、標的部位に到達した後にその中の代謝物とのみ反応を行うため、誘導体化反応のON、OFFをコントロールすることができる光反応を用いることとした。また、細胞内代謝物と光反応プローブが反応するための、光反応試薬の検討をおこなった。その結果、UVにより反応が進行し、比較的反応収率が良かったジアジリンを光反応基として使用することとした。さらに、モデル代謝物としてアミノ酸などを用いて、照射する光の波長や照射時間などの光反応誘導体化条件の検討を行った。さらに光反応により誘導体化した代謝物を質量分析計で検出するためのLC分離条件および質量分析計による検出条件の検討を行った。さらに質量分析計により検出された光反応誘導体化物とされるイオンについてMS/MSによるフラグメント解析を行い、代謝物の同定を行った。また、細胞内へ光反応誘導体化試薬を導入されたことを確認するために蛍光プローブにジアジリン光反応部位を有した試薬の合成を行った。
これまでの研究により、実際に細胞内で誘導体化反応するためのプローブ及び反応条件などの検討が終了することができたため、本年度は当初の予定通り、実際の細胞を用いた誘導体化を行うことが可能となった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今年度の研究で開発・合成した蛍光標識化光反応プローブが細胞内、さらには標的とする細胞内オルガネラへ移行するかについて、実際の培養細胞を用いて確認する。細胞観察には蛍光顕微鏡およびレーザー共焦点顕微鏡を使用する。また、蛍光波長をUVに切り替えることによって細胞内で光反応を進行させ、細胞内代謝物との誘導体化を行う。さらに、細胞内で誘導体化された代謝物を様々な夾雑物が存在する細胞抽出液から分離するため、誘導体化プローブを選択的にトラップして質量分析するための前処理方法の開発を行う。質量分析計により、誘導体化修飾された代謝物由来ピークを選択的に検出するために、質量分析計で検出されたイオンのMS/MSフラグメント化を行い、得られたフラグメントイオンピークの中から誘導体化プローブ分子特徴的なフラグメントピークを確認する。誘導体化代謝物である場合、検出された親イオンのm/z値から組成式を推定し、MS/MSフラグメントパターンから構造を推定し、代謝物の同定を行う予定である。
|
| Causes of Carryover |
物品購入の際の消費税分などの端数が生じてしまったことから、余剰金336円が生じてしまった。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
28年度に生じた余剰分は少額であるので29年度の予算使用計画自体の変更は無いが、物品の値上げや消費税分の支払いに使用する予定である。
|
