コレステロール代謝異常によるアルツハイマー疾患発症の解析

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K21317
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 山室 大介 自治医科大学, 医学部, リサーチレジデント (20739255)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 24S-ヒドロキシコレステロール / アルツハイマー型認知症 / NCEH1阻害剤 / ACAT1阻害剤

Outline of Annual Research Achievements

アルツハイマー型認知症(AD)の原因因子とされる脳内アミロイドβの沈着がコレステロール酸化代謝物のひとつである24S-ヒドロキシコレステロール(24S-HC)の脳内増加によって抑制される可能性が報告されてきた。その中、NCEH1欠損マウスの脳では野生型マウス脳に比べて24S-HCが有意に増加していた。そこで、NCEH1が脳内24S-HC量を規定することにより脳内アミロイドβの沈着を制御する可能性を検討した。
アミロイドβ沈着やタウ蛋白の過剰なリン酸化による神経細胞死はAD発症の一因となるが、脳内24S-HCも神経細胞死を誘発する。そこで細胞実験ではACAT1 阻害剤およびNCEH1阻害剤と24S-HCをSH-SY5Y細胞に作用させ、TUNEL染色法及びMTT assay にて細胞死を評価した。その結果、ACAT1 阻害剤では24S-HCが誘発する細胞死を有意に抑制した。また、細胞内24S-HC含量をLC-MS/MSを用いて測定した結果、 ACAT1阻害剤添加ではfree体が、NCEH1阻害剤添加ではester体が有意に増加した。次いでACAT1阻害剤及びNCEH1阻害剤の24S-HC添加時におけるAPP産生タンパク(APP、ADAM10、BACE-1、PS-1)への影響をwestern-blotting 法にて評価した結果、24S-HC添加時に見られたAPPタンパクの発現増加は阻害剤添加では影響を与えなかった。さらに、ELISA 法にてAβ分泌への影響を評価した結果、24S-HC添加時に見られたAβ1-40及びAβ1-42 分泌低下はACAT1阻害剤でのみ抑制された。
動物実験では固体作成を完了し、現在APP oligomer 過剰発現マウス (ADモデルマウス) とNCEH1欠損マウスを交配させ、NCEH1欠損APP oligomer 過剰発現マウスを作成した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の研究計画ではADモデルマウス(3XTg-ADマウス)とNCEH1欠損マウスを交配させ、NCEH1欠損ADモデルマウスを初年度に樹立する予定だったが、交配マウスの作成期間短縮を目的に、他のADモデルマウス (APP oligomer Tg マウス)を交配に使用する計画にした。APP oligomer Tg マウス導入にあたり、凍結精子からの受精胚作成・移植を行ったが、着床は認められたが妊娠の維持がされず、胚盤胞期までの発生状態を確認し、再度IVFによる受精胚の生産後、胚移植と凍結保存を行い、個体作成を行った為に動物実験に遅延が生じた。

Strategy for Future Research Activity

動物実験では、NCEH1欠損APP oligomer 過剰発現マウスに関して、脳海馬におけるAβ oligomer 沈着を抗Aβ oligomer 抗体による免疫組織化学染色法にて評価する。アミロイド前駆体蛋白(APP)からのアミロ イドβ産生を担うAPP切断酵素であるα,β,γ-secretase、アミロイドβ分解酵素のneprilysinおよびInsulin Degrading enzyme(IDE) といったAD疾患の原因分子をELISA kit、western-blottingや real-time PCRなどの生化学的手法を用いて解析していく。また、APP oligomer 過剰発現マウスおよびNCEH1欠損APP oligomer 過剰発現マウスにおける脳内CE量および24S-HC量をLC-MS/MSにて定量解析し、AD発症分子の発現量との相関関係を検証し、動物レベルでのNCEH1のAD発症への関与を明らかとする。
細胞実験では、ACAT1阻害剤及びNCEH1阻害剤と24S-HCをヒト神経芽細胞(SH-SY5Y細胞)に作用させ、細胞死、APPタンパクの発現増加及びAβ分泌を評価したが、NCEH1阻害剤によるこれらへの影響は見られなかった。24S-HCが誘発する細胞死はACAT1阻害剤でのみ抑制されたことから、ACAT1阻害剤による24S-HCが誘発する細胞死抑制とAβ分泌低下の抑制との関連について今後検討する。

Causes of Carryover

ADモデルマウスの個体作成に遅延が生じ、その解析も延期されたため、次年度使用額が生じた。
NCEH1欠損APP oligomer 過剰発現マウスに関して、脳海馬におけるAβ oligomer 沈着を抗Aβ oligomer 抗体による免疫組織化学染色法にて評価する。また、AD疾患の原因分子をELISA kit、western-blottingや real-time PCRなどの生化学的手法を用いて解析し、動物レベルでのNCEH1のAD発症への関与を明らかとする。