2017 Fiscal Year Research-status Report
SGA性低身長を呈するミトコンドリア呼吸鎖異常症での脂肪酸輸送体FATP3の役割
| Project/Area Number |
16K21331
|
|---|
| Research Institution | Ehime University |
|---|
Principal Investigator |
徳澤 佳美 愛媛大学, 医学系研究科, 助教(特定教員) (20406531)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | ミトコンドリア病 / ヒトiPS細胞 / エネルギー代謝 / 胎内発育不全 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
平成29年度は、我々が樹立したヒトiPS細胞でFATP3ノックアウト細胞を作成し、解析することを計画した。ゲノム編集によるFATP3遺伝子ターゲッティングを行うために、CRISPR/Cas9発現ベクターとFATP3ターゲッティングベクターの構築を行なった。FATP3にはisoformが3つ存在するため、実際にFATP3ターゲッティングに使用するヒトiPS細胞において、これらのisoformの発現量をqRT-PCRで測定した。その結果、FATP3の全てのisoformが発現していたことから、ヒトiPS細胞でFATP3の機能抑制の影響が表現型として出る可能性が示唆された。しかし、ヒトiPS細胞は通常、ミトコンドリア活性が抑制されており、分化誘導に伴い代謝が電子伝達系-酸化的リン酸化にスイッチすることが知られている。FATP3はミトコンドリアの呼吸鎖活性に関わっていると予想されるため、FATP3の発現抑制によるヒトiPS細胞への影響は、抑えることができると考えた。ターゲッティングのための予備実験として、使用予定のヒトiPS細胞への遺伝子導入条件と薬剤選択濃度の検討を行い、条件を決定した。
FATP3に遺伝子変異が同定された患者は、胎内発育不全を呈したことから、FATP3ノックアウトiPS細胞は分化誘導した時に増殖能の低下が予測される。そのためFATP3ノックアウトiPS細胞の解析には、ミトコンドリア呼吸鎖複合体の形成だけでなく、分化誘導効率の評価を行うことも重要と考えた。神経外胚葉への分化誘導方法は所属研究室において既に確立されているが、中内胚葉系への分化誘導方法は着手していなかったため、誘導条件の検討を行なった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
昨年度中に、FATP3ノックアウト細胞を作製し、ミトコンドリアの機能評価、分化能の評価まで終了する予定であったが、遺伝子導入の条件検討、及び分化誘導条件の検討の実施により、当初の計画のスケジュール変更を余儀なくされた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度は引き続き、FATP3ノックアウトiPS細胞の作製を行う。樹立後のヒトiPS細胞の評価系の構築は、ほぼ終了したので、樹立でき次第、ミトコンドリアの機能評価、分化能評価を実施したい。iPS細胞は分化に従って、ミトコンドリア呼吸鎖依存的なエネルギー代謝に移行するため、分化誘導中に細胞が死んでしまい、呼吸鎖複合体の解析に十分なミトコンドリアが取得できない可能性も考えられる。その場合は、ミトコンドリアDNA量の定量や、免疫染色によるイメージング、細胞外フラックスアナライザーによる酸素消費速度の測定を実施し、評価を試みたいと考えている。
|
| Causes of Carryover |
次年度の使用額として482,957円が生じたが、これは実験計画に遅れが生じたため、FATP3ノックアウトiPS細胞の解析に使用する試薬、消耗品の購入ができなかったためである。次年度繰越分は、FATP3ノックアウトiPS細胞のミトコンドリア機能の評価及び、分化能評価に使用する試薬、消耗品の購入に当てる予定である。
|
