2016 Fiscal Year Research-status Report
構造情報を突破口とした 6 量体 ATPase の構造機能解析
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16K21472
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
岸川 淳一 京都産業大学, 総合生命科学部, 研究助教 (80599241)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 6量体 ATPase / AAA+-ATPase / 回転分子モーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
AAA+-ATPase に代表される 6 量体 ATPase は、生体内の様々な生理現象に関わっており、その構造および機構を理解することは重要である。6 量体 ATPase の構造は共通しており、6つのプロトマーがリング状の複合体を形成し、機能を発揮する。この共通のコアとなる構造を理解することは、6量体 ATPase 全般を理解することに繋がる。本申請研究は、構造情報を突破口として、6 量体 ATPase の機構の理解を目指すものである。
現在、回転分子モーターである V1-ATPase の単粒子解析を進めている。V1-ATPase は、6 量体リング A3B3 に回転軸がささった構造をしている。単粒子解析では、A3B3 リングのみと、V1-ATPase 全体の両方を行っている。単粒子解析では、タンパク質分子を薄氷に包埋し、様々な角度から分子を撮影することが重要である。A3B3 リング、V1-ATPase ともに薄氷に包埋した際、同じ面を氷の表面に向けてしまい、様々な角度から分子を撮影することが困難であった。このタンパク質の向きの偏りを、タンパク質を氷に包埋する際にごく低濃度の界面活性剤を添加することで、一部解決できた。その結果、A3B3 リングの環状構造やその中に回転軸がささったV1-ATPase の構造が得られている。特に、V1-ATPase は現在～７オングストローム分解能の構造が得られており、今後、さらに単粒子画像を増やし、分解能を上げることを目指す。また、丁寧に構造のクラス分けを行い、中間体構造を明らかにしていく。
同じく６量体 ATPase であるべん毛タンパク質の FliI は、発現とATPase 活性は確認できているものの、安定性が低いため、解析が難しい。現在、安定性を向上させるために変異体の作成やドメインスワップによるキメラ複合体の構築を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
６ 量体 ATPase である V1-ATPase の単粒子解析による構造解析を行っている。V1-ATPase は、安定性も高く、最初のターゲットとして最適であると判断した。V1-ATPase の解析に用いた手法は他の６量体ATPase への適用も期待できる。
単粒子解析は、薄氷にタンパク質分子を包埋し、様々な角度から分子を撮影することで３次元構造を計算する手法である。V1-ATPase は、氷に包埋した際、同じ面を氷表面に向ける性質があり、様々な角度から撮影することが困難であった。氷に包埋する際に、ごく低濃度の界面活性剤を添加することで、この分子の向きの偏りを一部解消できた。その結果、A3B3 リング構造やその中心に刺さった回転軸の構造が～７オングストローム分解能で得られた。単粒子解析については、今後の道筋をたてられたと考えている。
同じく６量体ATPase であるべん毛タンパク質のFliI は、すでに発現系の構築は完了しており、そのATPase 活性も確認できた。電子顕微鏡撮影を行ったところ、明確な６量体のリング構造が確認できず、構造解析まで至っていない。非特異的な相互作用による、多量体の形成によるものと考えられたので、変異導入やドメインスワップによる６量体の安定化を図っている。現在、ドメインスワップによる単量体の発現は確認できている。また、次の６量体ATPase の候補として、せん毛タンパク質のPilF の発現系を構築中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
V1-ATPase の単粒子解析については、今後さらに電子顕微鏡像を撮影し、粒子数を増やすことで、より原子分解能の構造を得ることを目指す。また、撮影時に基質であるATP や阻害剤などを添加することで反応中間体の構造が得られる可能性がある。しかし、反応中間体は不安定で全単粒子にたいする割合は少ないと考えられるので、そのためにもより多くの電子顕微鏡像の撮影が必要であると考えている。さらに、V1-ATPase だけでなく、その活性中心である A3B3 リングについても単粒子解析を進め、V1-ATPase との比較から機能と構造の相関について議論を進める。
べん毛タンパク質のFliI については、今後も引き続き安定な６量体の発現・精製系の確立を目指す。ドメインスワップによる複合体の安定化を進めており、６量体 FliI が得られたら、生化学的解析および構造解析を行う。V1-ATPase の解析で得られた知見を用いて、FliI についても単粒子解析を進める。
FliI の安定的な発現・精製系の構築が難しい場合は、他の６量体ATPase をターゲットとして解析を進める。現在、せん毛タンパク質のPilF の発現系構築を行っている。この発現系が容易に確立できれば、このタンパク質の解析を優先に進める。
既に得られている V1-ATPase については、高速原子間力顕微鏡（HS-AFM）による解析も今後行う。FliI や PilF についても同様に精製系が確立でき次第、HS-AFM の解析に供する。HS-AFM により、1分子レベルでの構造変化を観察することで、反応に関わる速度定数などの情報を明らかにする。
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