2017 Fiscal Year Annual Research Report
High-speed single molecule imaging for evaluating the ERK transport mechanism locally around the nuclear pore complex
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16K21625
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
毛利 一成 国立研究開発法人理化学研究所, 生命システム研究センター, 研究員 (00567513)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ３次元１分子計測 / 蛍光相互相関分光法 / MAPK / ERK / 核膜孔 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞は外部刺激に応答するかしないかの二値的反応を示す。これは細胞内のシグナル伝達過程で選択されるが、特に増殖因子EGF刺激ではその一つの候補としてERKリン酸化とその核内移行が知られている。我々はリン酸化ERKレベルはアナログな応答を示すが、ERK核移行においてデジタルな応答に変換される可能性を示唆する結果を得ている。ERKは核内に移行する際、必ず核膜孔を通過するため、核膜孔がERKを通過させる酵素反応キネティクスに、アナログをデジタルに変換する特徴が含まれると考えられる。このキネティクスを明らかにするため細胞内蛍光タンパク質濃度を絶対定量するための蛍光相互相関分光法を、安価な共焦点顕微鏡装置で実現する新規手法を開発した。この手法とFRAP計測を統合し、核膜孔の酵素反応速度定数の推定を行った。この結果、ERKの濃度に依存した通過速度定数の上昇が見られたため、通過における協同性が示唆され、この傾向はERKの特定部位の変異体により阻害され、基質リン酸化阻害剤によっても阻害されたため、ERK自身の状態と周辺環境の両方に依存したものであることが示唆されている。さらにこのキネティクスと分子機構の詳細を明らかにするため、3次元１分子計測の実験系を全反射顕微鏡により開発し、ERKの核膜での１分子計測を実現した。これを用いて滞在時間の推定や通過過程の観察を行い、核膜孔の１つ１つがERKを通過させる素過程の計測を実現した。
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Research Products
(5 results)
